CADERNO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
Agrarian Sciences Journal
Controle in vitro de Colletotrichum truncatum do feio fava (Phaseolus lunatus) por
Trichoderma spp.
Otília Ricardo de Farias
1
, José Manoel Ferreira de Lima Cruz
2
, Ingrid Gomes Duarte
3
DOI: https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.18464
Resumo
A antracnose, causada por Colletotrichum truncatum é uma das principais ameaças a produção de feijão fava, com
isso, medidas de controle devem ser tomadas, visando minimizar os problemas ocasionados por essa doença, como
o uso de controle biológico a partir do emprego de Trichoderma spp.. Esta pesquisa objetivou-se avaliar o potencial
antagônico de cepas de Trichoderma spp. sobre Colletotrichum truncatum, in vitro. Foram selecionados cinco isolados
de Trichoderma spp. (TCH01, TCH02, TCH03, TCH04 e TCH05) no antagonismo a C. truncatum. Para testar o po-
tencial antagônico das cepas de Trichoderma sobre o patógeno, foi realizado o teste de confronto direto através da
metodologia de cultura pareada, no qual foi avaliado a classificação do agrupamento dos isolados do antagonista e
exames microscópicos a procurando sinais de micoparasitismo. Foi realizado também o teste de antibiose, onde ava-
liou-se medição do diâmetro das colônias, porcentagem de inibição do crescimento micelial, taxa crescimento micelial,
contagem de esporos e porcentagem de inibição da esporulação. Pelo teste de confronto direto, todos as cepas de
Trichoderma spp. foram agrupados na classe 1, ou seja, os mesmos cresceram sobre a colônia do patógeno, ocupando
toda placa. Também observou-se que os antagonistas possuem potencial contra C. truncatum no teste de antibiose,
com inibição do crescimento micelial e esporulação variando de 74,7% a 82,0% e 78,7% a 89,3%, respectivamente.
Todos as cepas avaliadas apresenta potencial antagônico sobre Colletotrichum truncatum.
Palavras-chave: Antagonismo. Antracnose. controle biológico. Phaseolus lunatus.
In vitro control of broad bean Colletotrichum truncatum (Phaseolus lunatus) by
Trichoderma spp.
Abstract
Anthracnose, caused by Colletotrichum truncatum is one of the main threats to the production of fava beans, therefore,
control measures must be taken, aiming to minimize the problems caused by this disease, such as the use of biological
control using Trichoderma spp.. This study aimed to evaluate the antagonistic potential of the strains of Trichoderma
spp. on Colletotrichum truncatum, in vitro. (TCH01, TCH02, TCH03, TCH04 and TCH05) in antagonism to C. trun-
catum. In order to test the antagonistic potential of Trichoderma isolates on the pathogen, the direct confrontation
test was performed using the paired culture methodology, in which the classification of the cluster of the antagonist
isolates and microscopic examinations looking for signs of mycoparasitism were evaluated. The antibiosis test was
also carried out, in which the measurement of colony diameter, percentage of mycelial growth inhibition, mycelial
growth rate, spore count and percentage of sporulation inhibition were evaluated. By the direct confrontation test,
all isolates of Trichoderma spp. were grouped in class 1, that is, they grew on the pathogen colony, occupying the
entire plate. It was also observed that the antagonists have potential against C. truncatum in the antibiosis test, with
1
Universidade Federal da Paraíba. Areia, Paraíba. Brasil.
https://orcid.org/0000-0002-0753-0712
2
Universidade Federal da Paraíba. Areia, Paraíba. Brasil.
https://orcid.org/0000-0002-5967-4056
3
Universidade Federal Rural de Pernambuco. Recife, Pernambuco. Brasil.
https://orcid.org/0000-0002-1002-3164
*otiliarfarias@gmail.com
Recebido para publicação em 25 de janeiro de 2020. Aceito para publicação em 03 de junho de 2020.
e-ISSN: 2447-6218 / ISSN: 2447-6218 / © 2009, Universidade Federal de Minas Gerais, Todos os direitos reservados.
de Farias, O. R. et al.
2
Cad. Ciên. Agrá., 12, 1-6. https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.18464
mycelial growth inhibition and sporulation ranging from 74.7% to 82.0% and 78.7% to 89.3%, respectively. All the
isolates evaluated were efficient antagonists for Colletotrichum truncatum.
Keywords: Antagonism. Anthracnose. Biological control. Phaseolus lunatus.
Introdução
O feijão fava (Phaseolus lunatus L.) é uma das
culturas de maior importância econômica e social para a
região Nordeste do Brasil, onde constitui uma importante
alternativa de renda para pequenos produtores que pra-
ticam a agricultura familiar, bem como fonte alimentar
para população devido ser nutricionalmente rica, prin-
cipalmente em proteínas, o que a faz ser utilizado tanto
na dieta humana como animal (Cavalcante et al., 2012).
Mesmo sendo uma cultura bem adaptada as
condições edafoclimáticas da Região Nordeste a mesma
apresenta baixa produtividade e vários são os fatores
que podem estar associados a isso, como a ocorrência
de doenças (Silva et al., 2014). Dentre as doenças que
acometem o feijão fava no seu cultivo e que pode estar
associados a baixa produtividade, a antracnose, causada
pelo Colletotrichum truncatum, se destaca como uma das
mais importantes (Nascimento et al., 2017).
A antracnose causa danos em folhas, ramos e
vagens, e quando o ataque do patógeno é mais severo
causa redução da produtividade e queda no valor dos
grãos comercializados (Lopes et al., 2010), com isso,
medidas de controle devem ser tomadas, para minimizar
os impactos negativos desse microrganismo nos campos
de cultivo.
Para doenças foliares, o controle químico é o mais
utilizado, no entanto, o mesmo torna-se normalmente
impraticável para antracnose do feijão fava, tendo em vista
seu alto custo e por não possuir fungicidas registrados
para essa doença na cultura (Henning et al., 2014). Além
disso, o uso de produtos químicos vem perdendo expres-
são, devido impactos negativos sobre o ambiente, animais
e homem, e pela procura por alimentos sem resíduos de
agrotóxicos pelo mercado consumidor e surgimento de
patógenos resistentes (Hillen et al., 2012).
Com isso, nos últimos anos, pesquisadores têm
buscado por métodos eficientes de manejo de doenças
baseados na utilização de controle biológico, a partir
do emprego de Trichoderma spp. (Carvalho et al., 2011;
Lazarotto et al., 2013; Pereira et al., 2014; Xue et al.,
2017; Farias et al., 2019).
Trichoderma spp., compreende fungos de vida
livre, que se reproduzem assexuadamente, presentes com
mais frequência em solos de regiões de clima temperado
e tropical (Machado et al., 2012). Esse microrganismo
atua no controle de diversos fitopatógenos por diferentes
mecanismos de ação, como antibiose, micoparasitismo,
produção de enzimas degradadoras da parede celular,
competição por nutrientes e substrato e indução de resis-
tência (Pereira et al., 2014). Também são caracterizados
por serem resistentes a substancias tóxicas produzidos
por outros microrganismos e tolerantes a diferentes tipos
de fungicidas (Daryaei et al., 2016), o que os tornam
de elevado interesse para uso como agente de controle
biológico de fitopatógenos.
Dessa maneira, estudos devem ser realizados
com a finalidade de atestar o potencial antagônico desse
microrganismos, com isso, a primeira etapa para avaliação
da capacidade de biocontrole de Trichoderma spp. é a
caracterização do potencial antagonista desses micror-
ganismos in vitro (Mbarga et al., 2012). Vários estudos
indicam que espécies de Trichoderma são agentes efica-
zes de biocontrole para o patógeno Colletotrichum spp.
(Chargas et al., 2016; Saxena et al., 2016; Cruz-Quiroz
et al., 2018; Costa et al., 2019).
Diante do exposto, objetivou-se avaliar o po-
tencial antagônico de cepas de Trichoderma spp. sobre
Colletotrichum truncatum, in vitro, responsável por danos
em plantas de feijão fava (Phaseolus lunatus L.).
Material e Métodos
O experimento foi conduzido no Laboratório de
Fitopatologia, do Departamento de Fitotecnia e Ciências
Ambientais (DFCA), do Centro de Ciências Agrárias (CCA),
na Universidade Federal da Paraíba (UFPB), Campus II,
Areia, PB, Brasil.
Os isolados de Trichoderma spp. e C. truncatum
utilizados nesta pesquisa pertencem à Coleção de Micror-
ganismo do Laboratório de Fitopatologia, da Universidade
Federal da Paraíba, Areia, Paraíba, Brasil. O patógeno foi
obtido a partir de isolamento de plantas com sintomas
de antracnose.
As cepas TCH01, TCH02, TCH03, TCH04 e TCH05
de Trichoderma spp. foram avaliados, pela técnica de
confrontação direta e antibiose, no antagonismo a Col-
letotrichum truncatum.
Para condução experimental, culturas puras ob-
tidas do patógeno e dos antagonistas, foram reativadas e
multiplicadas em meio de cultura BDA (batata-dextrose-
-ágar) e mantidas em câmara de incubação por oito dias
à temperatura de 25± 2°C com fotoperíodo de 12 horas.
Controle in vitro de Colletotrichum truncatum do feijão fava (Phaseolus lunatus) por Trichoderma spp.
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O teste do confronto direto foi realizado através
da metodologia de cultura pareada (Dennis; Webster,
1971). O patógeno foi repicado 3 dias antes de cada
isolado do antagonista, opostamente em cada placa Petri,
contendo meio de cultura BDA. As placas foram incubadas
a 25 ± 2°C, com fotoperíodo de 12 horas. O delineamento
foi inteiramente casualizados, utilizando-se quatro repe-
tições, sendo cada repetição compostas por 2 placas de
Petri.
Após 7 dias da repicagem dos isolados de Tri-
choderma spp., foram realizadas a classificação do agru-
pamento dos isolados do antagonista de acordo com
escala descrita por Bell et al. (1982), onde a classe 1:
Trichoderma spp. cresce sobre o patógeno e ocupa toda
a superfície do meio; classe 2: Trichoderma spp. cresce
sobre pelo menos 2/3 da superfície do meio; classe 3:
Trichoderma spp. ocupa aproximadamente metade da
superfície do meio; classe 4: Trichoderma spp. cresce
sobre 1/3 da superfície do meio; classe 5: Trichoderma
spp. não cresce e o patógeno ocupa toda a superfície da
placa.
Exames microscópicos foram feitos com aumento
de 100x, procurando sinais de micoparasitismo na zona
de interação entre os isolados de Trichoderma spp. e C.
truncatum.
Para teste de antibiose, um disco da colônia do
patógeno e um de cada antagonista foram adicionados
individualmente no centro de placas de Petri contendo
meio BDA. As placas de tamanho correspondente, con-
tendo o Trichoderma spp. foram sobrepostas com as com
C. truncatum e vedadas com plástico filme transparente e
incubadas a 25 ± 2°C, de forma que as bases superiores
fossem aquelas que continham o patógeno.
Durante 7 dias foi realizada, diariamente, a me-
dição do diâmetro das colônias de C. truncatum com uma
régua milimetrada, em dois eixos ortogonais, descartan-
do-se o disco repicado da colônia pura, sendo posterior-
mente calculada as médias. Esses dados foram utilizados
no cálculo da porcentagem de inibição do crescimento
micelial (PIC) e taxa crescimento micelial (Tx), com uso
das seguintes fórmulas: PIC = (C-T / C) × 100, onde
PIC = porcentagem de inibição; C = crescimento radial
do patógeno (mm) sozinho (controle); T = crescimento
radial do patógeno (mm) sobre a influência dos isolados
de Trichoderma spp. (Bastos, 1997). E Tx = Df/ND, sendo
Df= diâmetro final da colônia e ND = números de dias
de incubação
Ao final do experimento, foi feito a contagem
de conídios formados ao dia de incubação. Para tal,
em cada placa de Petri foram adicionados 10 mL de
água destilada esterilizada. A suspensão foi filtrada em
dupla gaze esterilizada e retirada uma alíquota de 10μL
e transferida para a câmara de Neubauer, na qual foi feita
a contagem de conídios/ml
-1
. Com os dados da contagem
de conídios também foi calculado a porcentagem de ini-
bição da esporulação (PIE) de acordo com as fórmulas
apresentadas a seguir: PIE = (Etc-C / Etc) × 100, onde
PIE = porcentagem de inibição da esporulação; Etc =
número de esporos do tratamento controle; C = número
de esporos do patógeno sobre influência dos isolados de
Trichoderma spp. (Bastos, 1997).
O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado (DIC). As médias foram com-
paradas pelo teste de Scort-Knott (p <0,05), utilizando
software estatístico Sisvar versão 5.4 (Ferreira, 2010).
Resultados e Discussão
Todos os 5 isolados de Trichoderma spp. foram
agrupados na classe 1, ou seja, os mesmos cresceram
sobre o patógeno e ocuparam toda a superfície do meio
(Tabela 1). Além de colonizar eficientemente o meio,
constatou-se que os mesmos produziram esporos em
abundância sobre as colônias de Colletotrichum truncatum.
Tabela 1 Classificação dos isolados de Trichoderma
spp. quanto ao antagonismo exercido sobre
Colletotrichum truncatum.
Tratamento Classe*
TCH01 1
TCH02 1
TCH 03 1
TCH04 1
TCH05 1
*Classificação em conformidade com a escala de Bell et al. (1982).
Segundo Mbarga et al. (2012) a primeira etapa
para avaliação da capacidade de biocontrole de Trichoder-
ma spp. é a caracterização do potencial antagonista desses
microrganismos, que são realizados através de estudos in
vitro. Xue et al. (2017) também sugerem que testes in vitro
devem ser utilizados, principalmente, quando se deseja
testar um grande número de cepas, como Trichoderma
spp., que são conhecidos como micoparasitas de pató-
genos. E com base nos resultados iniciais obtidos nesse
trabalho no teste de pareamento, observa-se que todos os
isolados de Trichoderma spp. podem ser utilizados como
agentes de controle biológico contra C. truncatum, pois os
mesmos encontram-se na classe 1, ou seja, são isolados
com potencial de utilização em casa de vegetação e em
campo (Tabela 1).
Nas observações microscópicas, o patógeno mos-
trou morfologia hifal anormal nas áreas de interação, so-
bre ação de todos os isolados estudados. Sendo a redução
do crescimento de C. truncatum atribuída à competição
por espaço, nutrientes presentes no meio de cultura e
micoparasitismo (Vinale et al., 2008), constituindo estes
como principais mecanismos utilizados pelo antagonista
de Farias, O. R. et al.
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Cad. Ciên. Agrá., 12, 1-6. https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.18464
em testes de biocontrole, como de confronto direto (Mil-
lanesi et al., 2013).
Segundo Dinesh et al. (2018), esses são uns dos
mecanismos utilizados por Trichoderma spp, que atuam
diretamente sobre o patógeno, principalmente através da
produção de enzimas líticas, como quitinases e β-1,3-glu
-
canases. Possuindo a capacidade de hidrolisar a parede
celular do patógeno, limitando assim o seu crescimento
(El_Komy et al., 2015).
Pelo teste de antibiose foi possível quantificar a
produção de metabólitos voláteis pelos isolados de Tri-
choderma spp., com redução significativa do crescimento
micelial, taxa de crescimento micelial diária e esporulação,
quando comparados com a testemunha (Tabela 2).
O crescimento micelial total foi de 85,0 mm e a
taxa de crescimento micelial diário foi de 12,1 mm dia-1
na testemunha, para as placas sobre influência dos me
-
tabolitos voláteis, o menor valor para crescimento micelial
do patógeno foi com a presença do isolado TCH04, com
médias de 15,3 mm e 2,1 mm dia-1, respectivamente
(Tabela 2).
Para esporulação, todos os isolados testados
diferiram significativamente da testemunha, com desta-
que aos isolados TCH02, TCH03, TCH04 e TCH05, com
valores médio de 7,5; 3,75; 6,0 e 5,25 conídios.ml-1,
respectivamente (Tabela 2).
Tabela 2 – Efeito inibidor de metabólitos voláteis de Trichoderma spp. sobre o crescimento micelial, taxa de crescimento
micelial (TX) e esporulação (E) de Colletotrichum truncatum.
Tratamento
Crescimento
(mm)
TX
(mm.dia
-1
)
E
(conídios.ml
-1
)
Testemunha 85,0a 12,1a 35,25a
TCH01 20,5b 2,9b 17,0b
TCH02 21,5b 3,1b 7,5c
TCH03 21,1b 3,0b 3,75c
TCH04 15,3c 2,1c 6,0c
TCH05 19,2b 2,7b 5,25c
CV (%) 16,67 16,67 7,79
Médias com letras iguais não diferem estatisticamente entre si pelo o teste de Scott Knott (p <0,05).
Para porcentagem de inibição do crescimento
micelial, não houve diferença significativa entre os iso-
lados de Trichoderma spp. testados, sendo observada
uma redução de 74,7% a 82,0% do crescimento de C.
truncatum, quando comparado a testemunha. Já para a
inibição da esporulação, os melhores resultados foram
evidenciados pelos isolados TCH02, TCH03, TCH04 e
TCH05, com valores de 78,7%, 89,3%, 82,9% e 85,1%,
respectivamente (Figura 1).
Os metabolitos voláteis produzidos pelo Trichoder-
ma spp. são substâncias com ação tóxica, que possuem a
capacidade de reduzir ou mesmo paralisar o crescimento
e a esporulação do patógeno (Bomfim et al., 2010). O
efeito dessas substâncias antifúngicas também foram
relatadas por Chagas Junior et al. (2016), ao avaliar o
potencial antagônico de Trichoderma spp. quanto a por-
centagem de inibição do crescimento de C. cliviae e C.
truncatum, onde observaram que os isolados reduziram
cercas de 75% e 90% do crescimento desses patógenos,
respectivamente. Fantinel et al. (2018) também obser-
varam redução de 44,2% das colônias de C. siamense em
função da ação inibitória dos metabolitos produzidos
por Trichoderma sp.. Oliveira et al. (2016), avaliando a
eficiência de isolado de Trichoderma sp. no controle de
C. musae, encontraram índices de inibição de 84 %.
Apesar da eficiência comprovado no controle de
diversos fungos fitopatogênicos, no Brasil, o controle bio-
lógico é pouco utilizado em condições de campo, devido
a limitada disponibilidade de produtos comerciais à base
desse fungo com registro no Ministério da Agricultura
Pecuária e Abastecimento (MAPA). Apesar dos esforços de
pesquisadores, a difusão de conceitos, vantagens e ações
dos produtos biológicos ainda é incipiente, o que possi-
bilita a manutenção da hegemonia do uso de produtos
químicos (Machado et al., 2012). Além disso, ainda
uma carência de respostas acerca das interações entre
antagonistas e o patossistemas da cultura da fava. A
realização de testes em laboratório e casa de vegetação e
a seleção de novos isolados de Trichoderma spp. obtidos
na nossa Região, adaptados as condições do Semiárido
é imprescindível na busca por novas perspectivas para
emprego do controle biológico no manejo de doenças
causadas por diversos patógenos em varias culturas.
Controle in vitro de Colletotrichum truncatum do feijão fava (Phaseolus lunatus) por Trichoderma spp.
5
Cad. Ciên. Agrá., 12, 1-6. https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.18464
Figura 1 – Efeito inibidor de metabólitos voláteis de Trichoderma spp. sobre porcentagem de inibição do crescimento
micelial e taxa de crescimento micelial de Colletotrichum truncatum.
Médias com letras iguais não diferem estatisticamente entre si pelo o teste de Scott Knott (p <0,05).
Conclusão
Todos as cepas avaliadas apresenta potencial
antagônico sobre Colletotrichum truncatum.
Evidencia-se a necessidade de testar esses isolados
de Trichoderma spp. em condições de casa de vegetação
e de campo, para comprovar seu potencial como agentes
de biocontrole da antracnose em feijão-fava, causada por
C. truncatum.
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