Estabelecimento
in vitro
de
Ceiba rubriflora
Carv.-Sobr. e L. P. Queiroz: uma espécie
endêmica do vale do rio
São Francisco
Anna Luiza Mota Docha
1
, Leandro Silva de Oliveira
2
, Nayara dos Santos de Souza
3
, Gilvano Ebling Brondani
4
*
DOI: https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.24029
Resumo
Ceiba rubriflora
é uma espécie nativa
da região do médio São Francisco que se encontra em risco crítico de extinção.
Em
decorrência do endemismo da espécie, a produção de sementes é escassa e a micropropagação apresenta-se como
ferramenta para
a propagação da espécie. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi estabelecer in vitro sementes
de C. rubriflora após
desinfestação com diferentes concentrações de cloro ativo e testar a multiplicação in vitro de
brotações apicais em diferentes
concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP). O estabelecimento in vitro das sementes foi realizado em meio de cultura MS, sendo
estas submetidas previamente
à desinfestação com hipoclorito de sódio
(NaOCl) nas concentrações de 0,0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,5%
de cloro ativo. Em condições in vitro, brotações apicais das plântulas germinadas foram utilizadas como explantes para a
multiplicação, em meio de cultura MS, suplementado com BAP nas concentrações de 0,0; 1,0 e 2,0 mg L-1. As avaliações
foram referentes à sobrevivência das plântulas, à contaminação fúngica e bacteriana e ao número de brotações por explante. A
germinação in vitro das sementes foi
superior a 98% com taxa de sobrevivência das plântulas maior que 50%. A porcentagem
total de contaminação fúngica
foi de apenas 2%, isenta de culturas bacterianas. Não houve multiplicação das brotações apicais
de C. rubriflora em um único subcultivo in vitro em meio de cultura com BAP. Os resultados demonstram a viabilidade da
germinação in vitro de sementes de C. rubriflora para a introdução e posterior processo de micropropagação, abrindo
perspectivas para maiores estudos com a espécie.
Palavras-chave
: Paineira rubi. Mata seca. Conservação de espécie. Micropropagação.
In vitro
establishment of
Ceiba rubriflora
Carv.-Sobr. e L. P. Queiroz: an endemic species of
the São Francisco
River Valley
Abstract
Ceiba rubriflora is a native Brazilian species, critically endangered, from region of middle São Francisco River. C.
rubriflora’s seed production is scarce because of its endemism. Therefore, the micropropagation is presented as a tool for its
propagation and seedling production. Thus, the aim of the present study was to evaluate the in vitro establish- ment of C.
rubriflora seeds after disinfestation with different concentrations of active chlorine and testing the in vitro multiplication of
apical shoots in different concentrations of 6-benzylaminopurine (BAP). The in vitro establishment of seeds was performed in
MS culture medium, which were previously submitted to sodium hypochlorite (NaOCl) disinfection at concentrations of 0.0;
0.5; 1.0; 1.5; and 2.5% active chlorine. Apical shoots of in vitro germinated seedlings were used as explants for
multiplication, in MS culture medium, supplemented with BAP in concentrations of 0.0; 1.0 and 2.0 mg L-1. The evaluations
were related to seedling survival, fungal and bacterial contamination and
1Universidade Federal de Minas Gerais, Curso de Engenharia Florestal, Campus Montes Claros. Montes Claros, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0002-2903-4357
2Universidade Federal de Minas Gerais, Curso de Engenharia Florestal, Campus Montes Claros. Montes Claros, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0003-0800-5001
3Universidade Federal de Minas Gerais, Curso de Engenharia Florestal, Campus Montes Claros. Montes Claros, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0003-3691-7294
4Universidade Federal de Lavras, Curso de Engenharia Florestal. Lavras, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0001-8640-5719
* Autor para correspondência: lsoliveira@ufmg.br
Artigo recebido para publicação em 08 de julho de 2020. Artigo aceito para publicação em 24 de agosto de 2020
e-ISSN: 2447-6218 /
ISSN: 2447-6218. Atribuição CC BY.
CADERNO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
Agrarian Sciences Journal
2
Docha, A. L. M. et al.
number of shoots per explant. The in vitro germination of seeds was satisfactory, with survival rate higher than 98%. The
percentage of in vitro contamination was only 2%, free from bacterial cultures. The apical shoots of C. rubriflora were not
multiplied in a single subculture in vitro in BAP culture medium. The results demonstrate the viability of in vitro germination
of C. rubriflora seeds for the introduction and subsequent micropropagation process, opening perspectives for further studies
with the species.
Keywords: Ruby paineira. Calcareous Dry Forest. Species conservation. Micropropagation.
Introdução
Ceiba rubriflora é uma árvore nativa do Brasil, de
ocorrência natural na região do médio São Francisco nas
fitofisionomias da Caatinga (stricto sensu), Floresta
Estacional Semidecidual, e vegetação sobre Afloramentos
Rochosos (REFLORA, 2019). As árvores podem atingir
mais de 20 metros de altura e a espécie se destaca na
paisagem árida, pelo florescimento em plena estação seca,
com
flores de pétalas vermelhas. (Carvalho-Sobrinho e Queiroz,
2008; Mahr, 2009).
hipoclorito de sódio (NaOCl) na desinfestação das se-
mentes para germinação in vitro e (2) avaliar a o efeito do
BAP na multiplicação in vitro de brotações apicais.
Material vegetal
Frutos da C. rubriflora foram coletados de uma
árvore matriz crescendo em um afloramento calcário numa
área de Mata Seca na Fazenda Pequi-Porteirinha
(16°45’38”S, 43°54’07”W) da Universidade Federal de
Minas Gerais (UFMG) em Montes Claros - MG. Para a
realização do presente estudo, um dos frutos foi arma-
zenado em ambiente seco e à temperatura ambiente até sua
completa maturação e deiscência no Laboratório de
Melhoramento Florestal da UFMG, campus Montes Claros.
Após abertura espontânea do fruto procedeu-se
o
beneficiamento das sementes e as mesmas foram arma-
zenadas em recipiente plástico sob temperatura ambiente
(±
24°C) durante 6 meses.
Atualmente, o habitat natural da C. rubriflora
encontra-se fragmentado e degradado. Cerca de 46% da
cobertura vegetal original da Caatinga foi suprimida da sua
área original pela intervenção humana (MMA, 2019). Isso
agrava-se pelo endemismo da C. rubriflora,
pois a baixa
densidade de indivíduos numa área, limita a
produção de
sementes, que garantiria a perpetuação da
espécie. Em
decorrência disso, a C. rubriflora encontra-se
sob risco de
extinção e assim há urgência na realização de estudos
relacionados a propagação da espécie.
Estabelecimento e multiplicação
in vitro
Nesse contexto, a micropropagação apresenta-se
como uma ferramenta com potencial de viabilizar a con-
servação e multiplicação de espécies e/ou genótipos em
risco
de extinção, tais como a C. rubriflora. Muitas espécies
florestais
ameaçadas de extinção com valor comercial e ornamental,
tais como Moringa peregrina, Renanthera
imschootiana,
Aegiphila verticillata, C. petandra, Cariniana legalis, têm sido
protegidas e multiplicadas via propagação in vitro (Al-Khateeb
et al., 2013; Wu et al., 2014; Almeida
et al., 2015; Aragão et
al., 2018). Contudo, não há ainda estudos na literatura que
reportam o cultivo in vitro de
C. rubriflora.
O procedimento foi executado no Laboratório de
Biotecnologia, do Centro de Pesquisas em Ciências
Agrárias (CPCA) do Instituto de Ciências Agrárias da
UFMG.
No estabelecimento in vitro foi realizado expe-
rimento de desinfestação das sementes de C. rubriflora.
Inicialmente, as sementes foram lavadas em água corrente
durante 20 minutos com duas gotas de detergente Spa Soft®
neutro. Lavadas em água deionizada autoclavada por três
vezes e em capela de fluxo laminar, as sementes foram
imersas em solução de álcool (70%) durante 30
segundos,
em seguida, imersas em diferentes soluções de NaOCl nas
concentrações 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; e 2,5% (v/v)
de cloro ativo
por 15 minutos e adicionadas 3 gotas do detergente Spa
Soft® neutro, em agitação constante. Ao
término da
desinfestação, as sementes foram lavadas em
água deionizada
autoclavada por quatro vezes e então
inoculadas
individualmente em tubos de ensaio contendo
meio de cultura
MS (Murashige; Skoog, 1962), suple- mentado com
sacarose (30,0 mg L-1), solidificado com
ágar (7,0 mg L
-1
) e
pH ajustado para 5,8. O delineamento experimental utilizado
foi inteiramente casualizado (DIC),
com 5 tratamentos e 30
repetições por tratamento, onde cada unidade experimental
foi constituída por um tubo
de ensaio contendo uma semente.
Aos 21 dias foram ava-
liados o número de sementes
germinadas (após emissão
O estabelecimento in vitro corresponde à pri-
meira etapa da micropropagação. A avaliação de agentes
desinfetantes na introdução in vitro dos explantes, como
o
cloro ativo, tem sido determinante para o seu sucesso
(Pasqual et al., 2010; Brondani et al., 2013). Ademais,
vários fatores podem interferir na multiplicação in vitro dos
explantes, como reguladores de crescimento, a oti- mização
de suas concentrações potencializa a produção de propágulos
vegetativos. O regulador de crescimento 6-
benzilaminopurina (BAP) tem sido utilizado com efi-
ciência
para a multiplicação in vitro dos diversos tipos de
explantes de
diferentes espécies (Oliveira et al., 2015).
Dada a importância de estabelecer e desenvolver
de
um protocolo de cultivo in vitro de C. rubriflora, os
objetivos do presento estudo foram: (1) avaliar a ação
Cad. Ciênc. Agrá., v. 12, p. 01–05, https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.24029
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Docha, A. L. M. et al.
da radícula) e de plântulas sobreviventes; o número de
sementes com contaminação fúngica e bacteriana.
fotoperíodo de 16 horas, na temperatura de 25±2°C, sob
densidade média de fluxo de fótons de 26±2 µmol m-2 s-1,
obtidas por lâmpadas brancas fluorescentes.
Na etapa de multiplicação in vitro, após a germi-
nação, brotações apicais foram excisadas das plântulas de
C. rubriflora germinadas in vitro e inoculadas individual-
mente em tubos de ensaio contendo meio de cultura MS,
com
pH ajustado para 5,8, suplementado com sacarose (30,0 mg
L-1), ágar (7,0 mg L-1) e 6-benzilaminopurina (BAP)
disposto em três tratamentos nas concentrações de 0; 1,0 e
2,0 mg/L. O experimento de foi realizado em
delineado
experimental inteiramente casualizado (DIC),
com 3
tratamentos e 15 repetições por tratamento, sen- do a
unidade experimental constituída por um tubo de ensaio
contendo um ápice meristemático. Após 21 dias
o
experimento foi avaliado pela contagem do número de
brotações nos explantes apicais.
Os dados mensurados foram submetidos ao teste
de
Hartley (p < 0,01) e de Lilliefors (p < 0,01) previa- mente à
análise de variância (ANOVA, p < 0,01) a 1% de
probabilidade de erro, sendo as médias comparadas através
de um gráfico de barras.
Cultivo
in vitro
de
C. rubriflora
O estabelecimento in vitro das sementes de C.
rubriflora com a desinfestação com NaOCl demonstrou
ser
um procedimento eficiente, com 98% de germinação,
considerando todos os tratamentos, demonstrando que a
ação
do cloro ativo sobre as sementes não compromete sua
germinação (FIGURA 1).
Em ambos os experimentos, os tratamentos foram
mantidos em câmara de crescimento por 21 dias, com
Figura 1 – Etapas do estabelecimento in vitro de sementes e desenvolvimento in vitro de plântulas de Ceiba rubriflora.
(A) Semente inoculada em meio MS; (B) Emissão da radícula; (C) Plântula desenvolvida; Brotações apicais
de C.
rubriflora no meio de multiplicação in vitro com formação de raízes adventícias (
D
) e de calos na região
basal nos
tratamentos com 1,0 mg L-1 (E) e 2,0 mg L-1 (F) de BAP, após 30 dias de cultivo in vitro. Barras = 1 cm.
Não houve diferença entre estes quanto a sobre-
vivências das plântulas, após 21 dias de cultivo in vitro. No
entanto, nem todas as sementes que germinaram
completaram seu desenvolvimento, após emissão de ra-
dícula. No presente estudo, a sobrevivência de plântulas foi
superior a 50% para todos os tratamentos (FIGURA 2),
indicando que as sementes C. rubriflora coletados de frutos
ainda fechados não necessitam de tratamento de
desinfestação.
de sementes de espécies florestais tem papel importante na
sua germinação, devido a ocorrência de perdas por
deterioração e lesões ao embrião, o que enfatiza a impor-
tância de tratamentos de assepsia eficazes (Lazarotto et al.,
2011). Portanto, atrelado ao tratamento de assepsia,
a adoção
de práticas que minimizem a contaminação das
sementes,
como a coleta do fruto antes da sua queda e deiscência,
além do armazenamento laboratorial, pode ser decisiva para
o sucesso do estabelecimento in vitro.
Ademais, a desinfestação das sementes é eficien-
te
mesmo em concentrações baixas, inferior ou igual a 0,5%
de cloro ativo, visto que as plântulas germinadas in vitro
não apresentaram contaminação bacteriana e a taxa de
contaminação fúngica total foi de apenas 2%. Tal resultado,
pode estar correlacionado ao fato de as sementes terem sido
obtidas de frutos imaturos, antes da sua deiscência.
Lazarotto et al (2010) afirmam que a contaminação das
sementes e frutos de essências flo- restais ocorre
predominantemente no solo, onde são colonizados por
diversos fungos. A qualidade sanitária
O cultivo in vitro dos explantes apicais de C. ru-
briflora em meio de cultura suplementado com BAP não
proporcionou o desenvolvimento de novas brotações. A
dominância apical dos explantes e o fato de ter sido rea-
lizado um único cultivo in vitro, provavelmente, influen- ciou
na ausência de multiplicação de novas brotações. Por sua
vez, no tratamento isento de BAP, os explantes
apresentaram
a formação de raízes adventícias (FIGURA
1D). Nos
tratamentos com BAP, os explantes apresen- taram a
formação de calos em sua região basal, sendo estes maiores
na concentração de 2,0 mg L-1 (FIGURA
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Docha, A. L. M. et al.
1E-F). O uso de outro regulador de crescimento com ação
citocínica, além de BAP, pode aumentar a proliferação de
brotações de C. rubriflora, conforme reportado para
C. pentandra com o uso das citocininas, BAP, cinetina
(CIN) e thidiazuron (TDZ) (Silva et al., 2010). Além disso,
a resposta calogênica dos explantes ao BAP pode ser
explicada pelo desequilíbrio no balanço endógeno entre
auxina e citocinina nos mesmos, acarretando um
desenvolvimento celular desorganizado, ou seja, formação de
calos (Takahashi, 2002). A literatura reporta que além do uso
de reguladores de crescimento no meio de cultura,
a retirada do
meristema apical no primeiro subcultivo é uma alternativa
para a redução da dominância apical e indução do
desenvolvimento das brotações axilares dos explantes
(George et al., 2008; Stephin et al., 2019).
Figura 2 – Valores médios da sobrevivência de plântulas de C. rubriflora nos tratamentos com hipoclorito de sódio (NaOCl)
nas concentrações de 0,0; 05; 1,0; 1,5 e 2,5 % de cloro ativo na desinfestação das sementes no estabelecimento in
vitro. Barras indicam o desvio padrão da média.
Os resultados apresentados neste estudo repre-
sentam um avanço na micropropagação de C. rubriflora.
Demonstrando um esforço para desenvolver metodologias de
preservação e proteção desta espécie endêmica. Além
disso,
novas perspectivas se abrem para o desenvolvi- mento de
protocolos de propagação in vitro com fins de obtenção de
mudas de C. rubriflora em larga escala
50%. As concentrações de BAP não induziram brotações
a
partir de explantes apicais de C. rubriflora em um único
cultivo.
Agradecimentos
A Professora Rúbia dos Santos Fonseca pela dis-
ponibilização dos frutos de C. rubriflora para a realização
do
estudo.
Conclusão
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cien-
tífico e Tecnológico (CNPq) e à Pró-reitoria da Pesquisa da
UFMG pela concessão de bolsa de Iniciação Científica à
primeira autora.
O estabelecimento in vitro de sementes de C.
rubriflora a partir de tratamento de assepsia com NaOCl,
independente da concentração de cloro ativo, é eficiente.
A
germinação in vitro total das sementes foi superior a
98% e
com taxa de sobrevivência de plântulas superior a
Referências
Al-Khateeb, W., Bahar, E., Lahham, J.; Schroeder, D. 2013. Regeneration
and
assessment of genetic fidelity of the endangered tree Moringa peregrina
(Forsk.) Fiori using Inter Simple Sequence Repeat (ISSR). Physiol Mol
Biol Plants, 19: 157–164. doi: https://doi.org/10.1007/ s12298-012-0149-z.
Aragão, V. P. M.; Navarro, B. V.; da Silva, A. T.; Silveira, V.; Santa-
Catarina, C. 2018. Micropropagation of Cariniana legalis (Martius)
O. Kuntze, an endangered hardwood tree from the Brazilian Atlantic
Forest. Plant Cell Culture & Micropropagation, 13: 41–50. Disponível
em:
http://pccm.ufla.br/index.php/plantcellculturemicropropagation/
article/view/116/60.
Almeida, L. M. S.; Morais, L. E.; Resende, C. F.; Braga, V. F.; Pereira, P. F.;
Silva, R. A. C; Peixoto, P. H. P. 2015. Micropropagation and acclimatization
of
Aegiphila Verticillata Vell.: an endangered woody species. Revista
Árvore, 39: 305–314. doi: https://dx.doi.org/10.1590/0100-
67622015000200010.
Brondani, G. E.; Oliveira, L. S. D.; Bergonci, T.; Brondani, A. E.; França,
F. A. M.; Silva, A. L. L. D.; Gonçalves, A. N. 2013. Chemical sterilization
of
culture medium: a low cost alternative to in vitro establishment of plants.
Scientia Forestalis, 41: 257–264. Disponível em: https://www.
ipef.br/publicacoes/scientia/nr98/cap11.pdf.
Cad. Ciênc. Agrá., v. 12, p. 01–05, https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.24029
5
Docha, A. L. M. et al.
Pasqual, M.; Dutra, L. F.; Araujo, A. G.; Pereira, A. R. 2010. Prevenção de
Contaminações microbianas na cultura de células, tecidos e órgãos
de
plantas. 61–161. In: Scherwinski-Pereira, J.E. (Ed.). Contaminações
microbianas na cultura de células, tecidos e órgãos de plantas. Embrapa
Informação Tecnológica, Brasília, DF, Brasil: Embrapa Informação
Tecnológica.
Carvalho-Sobrinho, J. G.; Queiroz, L. P. 2008. Ceiba rubriflora (Malvaceae:
Bombacoideae), a new species from Bahia, Brazil. Kew Bulletin, 63: 649–
653. doi: http://dx.doi.org/10.1007%2Fs12225-008-9070-6.
Ceiba in Flora do Brasil 2020 em construção. Jardim Botânico do Rio de
Janeiro. 2019. Disponível em: http://reflora.jbrj.gov.br/reflora/
floradobrasil/FB115104.
REFLORA - Flora do Brasil 2019 em construção. Jardim Botânico do Rio
de Janeiro. Disponível em: http://floradobrasil.jbrj.gov.br/.
George, E. F.; Hall, M. A.; De Klerk, G. J. (Ed.). 2008. Plant propagation
by
tissue culture: volume 1. Springer Netherlands.
Silva, P. P.; Contim, L. A. S.; Freitas, D. V.; Aride, P. H. R.; Santos, A. L.
W. 2010. Estabelecimento in vitro de ápices caulinares de sumaúma
(Ceiba
pentandra L. Gaertn). Scientia Agraria, 11: 437–443. doi: http://
dx.doi.org/10.5380/rsa.v11i6.20389.
Lazarotto, M.; Muniz, M. F. B.; Santos, A. F. 2010. Detection, transmission,
pathogenicity and chemical treatment of fungi in Ceiba speciosa seeds.
Summa Phytopathologica, 36:134–139. doi: https://doi.org/10.1590/
S0100-
54052010000200005.
Stephin, S., Gangaprasad, A., Mathew, S.P. 2019. Enhanced in vitro shoot
multiplication of Piper sarmentosum by suppression of apical dominance.
Proceedings of the National Academy of Sciences, India Section B:
Biological Sciences, 89: 1–8. doi: https://doi.org/10.1007/ s40011-019-
01086-w.
Lazarotto, M.; Piveta, G.; Muniz, M. F. B.; Reiniger, L. R. S. 2011.
Adequação do teste de tetrazólio para avaliação da qualidade de
sementes
de Ceiba speciosa. Semina: Ciências Agrárias, 32, 1243–1250.
doi:
https://doi.org/10.5433/1679-0359.2011v32n4p1243.
Takahashi, E. K. Transferência do gene atacina A para plantas de maracujá
amarelo (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg.) por biobalística. 2002.
Tese Doutorado. Piracicaba: Universidade de São Paulo, 137f. Disponível
em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/ tde-03122002-
083637/.
Mahr, D. L. 2009. Some Succulent Trees of Bahia and Minas Gerais,
Brazil. Cactus and Succulent Journal, 81: 138–146. doi: https://doi.
org/10.2985/015.081.0308.
MMA - Ministério do Meio Ambiente. 2019. Caatinga. Disponível em:
https://www.mma.gov.br/biomas/caatinga.
Wu, K., Zeng, S., Lin, D., da Silva, J. A. T., Bu, Z., Zhang, J., & Duan,
J. 2014. In vitro propagation and reintroduction of the endangered
Renanthera imschootiana Rolfe. Plos One, 9: e110033. doi: https://
doi.org/10.1371/journal.pone.0110033.
Murashige, T.; Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio
assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15,
473–497.
doi: https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.
Oliveira, L. S.; Brondani, G. E.; Batagin-Piotto, K. D.; Calsavara, R.;
Gonçalves, A. N.; Almeida, M. D. 2015. Micropropagation of Eucalyptus
cloeziana mature trees. Australian Forestry, vol. 78, 219–231. doi:
https://doi.org/10.1080/00049158.2015.1073211.
Cad. Ciênc. Agrá., v. 12, p. 01–05, https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.24029
