CADERNO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
Agrarian Sciences Journal
Estabelecimento in vitro de Ceiba rubriflora Carv.-Sobr. e L. P. Queiroz: uma espécie
endêmica do vale do rio São Francisco
Anna Luiza Mota Docha
1
, Leandro Silva de Oliveira
2
, Nayara dos Santos de Souza
3
, Gilvano Ebling Brondani
4
*
DOI: https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.24029
Resumo
Ceiba rubriflora é uma espécie nativa da região do médio São Francisco que se encontra em risco crítico de extinção.
Em decorrência do endemismo da espécie, a produção de sementes é escassa e a micropropagação apresenta-se como
ferramenta para a propagação da espécie. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi estabelecer in vitro sementes
de C. rubriflora após desinfestação com diferentes concentrações de cloro ativo e testar a multiplicação in vitro de
brotações apicais em diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP). O estabelecimento in vitro das sementes
foi realizado em meio de cultura MS, sendo estas submetidas previamente à desinfestação com hipoclorito de sódio
(NaOCl) nas concentrações de 0,0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,5% de cloro ativo. Em condições in vitro, brotações apicais das
plântulas germinadas foram utilizadas como explantes para a multiplicação, em meio de cultura MS, suplementado
com BAP nas concentrações de 0,0; 1,0 e 2,0 mg L
-1
. As avaliações foram referentes à sobrevivência das plântulas, à
contaminação fúngica e bacteriana e ao número de brotações por explante. A germinação in vitro das sementes foi
superior a 98% com taxa de sobrevivência das plântulas maior que 50%. A porcentagem total de contaminação fúngica
foi de apenas 2%, isenta de culturas bacterianas. Não houve multiplicação das brotações apicais de C. rubriflora em
um único subcultivo in vitro em meio de cultura com BAP. Os resultados demonstram a viabilidade da germinação in
vitro de sementes de C. rubriflora para a introdução e posterior processo de micropropagação, abrindo perspectivas
para maiores estudos com a espécie.
Palavras-chave: Paineira rubi. Mata seca. Conservação de espécie. Micropropagação.
In vitro establishment of Ceiba rubriflora Carv.-Sobr. e L. P. Queiroz: an endemic species of
the São Francisco River Valley
Abstract
Ceiba rubriflora is a native Brazilian species, critically endangered, from region of middle São Francisco River. C.
rubriflora’s seed production is scarce because of its endemism. Therefore, the micropropagation is presented as a tool
for its propagation and seedling production. Thus, the aim of the present study was to evaluate the in vitro establish-
ment of C. rubriflora seeds after disinfestation with different concentrations of active chlorine and testing the in vitro
multiplication of apical shoots in different concentrations of 6-benzylaminopurine (BAP). The in vitro establishment
of seeds was performed in MS culture medium, which were previously submitted to sodium hypochlorite (NaOCl)
disinfection at concentrations of 0.0; 0.5; 1.0; 1.5; and 2.5% active chlorine. Apical shoots of in vitro germinated
seedlings were used as explants for multiplication, in MS culture medium, supplemented with BAP in concentrations
of 0.0; 1.0 and 2.0 mg L
-1
. The evaluations were related to seedling survival, fungal and bacterial contamination and
1Universidade Federal de Minas Gerais, Curso de Engenharia Florestal, Campus Montes Claros. Montes Claros, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0002-2903-4357
2
Universidade Federal de Minas Gerais, Curso de Engenharia Florestal, Campus Montes Claros. Montes Claros, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0003-0800-5001
3
Universidade Federal de Minas Gerais, Curso de Engenharia Florestal, Campus Montes Claros. Montes Claros, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0003-3691-7294
4Universidade Federal de Lavras, Curso de Engenharia Florestal. Lavras, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0001-8640-5719
* Autor para correspondência: lsoliveira@ufmg.br
Artigo recebido para publicação em 08 de julho de 2020. Artigo aceito para publicação em 24 de agosto de 2020
e-ISSN: 2447-6218 / ISSN: 2447-6218 / © 2009, Universidade Federal de Minas Gerais, Todos os direitos reservados.
Docha, A. L. M. et al.
2
Cad. Ciênc. Agrá., v. 12, p. 01–05, https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.24029
number of shoots per explant. The in vitro germination of seeds was satisfactory, with survival rate higher than 98%.
The percentage of in vitro contamination was only 2%, free from bacterial cultures. The apical shoots of C. rubriflora
were not multiplied in a single subculture in vitro in BAP culture medium. The results demonstrate the viability of
in vitro germination of C. rubriflora seeds for the introduction and subsequent micropropagation process, opening
perspectives for further studies with the species.
Keywords: Ruby paineira. Calcareous Dry Forest. Species conservation. Micropropagation.
Introdução
Ceiba rubriflora é uma árvore nativa do Brasil,
de ocorrência natural na região do médio São Francisco
nas fitofisionomias da Caatinga (stricto sensu), Floresta
Estacional Semidecidual, e vegetação sobre Afloramentos
Rochosos (REFLORA, 2019). As árvores podem atingir
mais de 20 metros de altura e a espécie se destaca na
paisagem árida, pelo florescimento em plena estação seca,
com flores de pétalas vermelhas. (Carvalho-Sobrinho e
Queiroz, 2008; Mahr, 2009).
Atualmente, o habitat natural da C. rubriflora
encontra-se fragmentado e degradado. Cerca de 46%
da cobertura vegetal original da Caatinga foi suprimida
da sua área original pela intervenção humana (MMA,
2019). Isso agrava-se pelo endemismo da C. rubriflora,
pois a baixa densidade de indivíduos numa área, limita a
produção de sementes, que garantiria a perpetuação da
espécie. Em decorrência disso, a C. rubriflora encontra-se
sob risco de extinção e assim há urgência na realização
de estudos relacionados a propagação da espécie.
Nesse contexto, a micropropagação apresenta-se
como uma ferramenta com potencial de viabilizar a con-
servação e multiplicação de espécies e/ou genótipos em
risco de extinção, tais como a C. rubriflora. Muitas espécies
florestais ameaçadas de extinção com valor comercial e
ornamental, tais como Moringa peregrina, Renanthera
imschootiana, Aegiphila verticillata, C. petandra, Cariniana
legalis, têm sido protegidas e multiplicadas via propagação
in vitro (Al-Khateeb et al., 2013; Wu et al., 2014; Almeida
et al., 2015; Aragão et al., 2018). Contudo, não ainda
estudos na literatura que reportam o cultivo in vitro de
C. rubriflora.
O estabelecimento in vitro corresponde à pri-
meira etapa da micropropagação. A avaliação de agentes
desinfetantes na introdução in vitro dos explantes, como
o cloro ativo, tem sido determinante para o seu sucesso
(Pasqual et al., 2010; Brondani et al., 2013). Ademais,
vários fatores podem interferir na multiplicação in vitro
dos explantes, como reguladores de crescimento, a oti-
mização de suas concentrações potencializa a produção
de propágulos vegetativos. O regulador de crescimento
6-benzilaminopurina (BAP) tem sido utilizado com efi-
ciência para a multiplicação in vitro dos diversos tipos de
explantes de diferentes espécies (Oliveira et al., 2015).
Dada a importância de estabelecer e desenvolver
de um protocolo de cultivo in vitro de C. rubriflora, os
objetivos do presento estudo foram: (1) avaliar a ação
hipoclorito de sódio (NaOCl) na desinfestação das se-
mentes para germinação in vitro e (2) avaliar a o efeito
do BAP na multiplicação in vitro de brotações apicais.
Material vegetal
Frutos da C. rubriflora foram coletados de uma
árvore matriz crescendo em um afloramento calcário
numa área de Mata Seca na Fazenda Pequi-Porteirinha
(16°45’38”S, 43°54’07”W) da Universidade Federal de
Minas Gerais (UFMG) em Montes Claros - MG. Para a
realização do presente estudo, um dos frutos foi arma-
zenado em ambiente seco e à temperatura ambiente até
sua completa maturação e deiscência no Laboratório
de Melhoramento Florestal da UFMG, campus Montes
Claros. Após abertura espontânea do fruto procedeu-se
o beneficiamento das sementes e as mesmas foram arma-
zenadas em recipiente plástico sob temperatura ambiente
(± 24°C) durante 6 meses.
Estabelecimento e multiplicação in vitro
O procedimento foi executado no Laboratório
de Biotecnologia, do Centro de Pesquisas em Ciências
Agrárias (CPCA) do Instituto de Ciências Agrárias da
UFMG.
No estabelecimento in vitro foi realizado expe-
rimento de desinfestação das sementes de C. rubriflora.
Inicialmente, as sementes foram lavadas em água corrente
durante 20 minutos com duas gotas de detergente Spa
Soft
®
neutro. Lavadas em água deionizada autoclavada
por três vezes e em capela de fluxo laminar, as sementes
foram imersas em solução de álcool (70%) durante 30
segundos, em seguida, imersas em diferentes soluções de
NaOCl nas concentrações 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; e 2,5% (v/v)
de cloro ativo por 15 minutos e adicionadas 3 gotas do
detergente Spa Soft
®
neutro, em agitação constante. Ao
término da desinfestação, as sementes foram lavadas em
água deionizada autoclavada por quatro vezes e então
inoculadas individualmente em tubos de ensaio contendo
meio de cultura MS (Murashige; Skoog, 1962), suple-
mentado com sacarose (30,0 mg L
-1
), solidificado com
ágar (7,0 mg L
-1
) e pH ajustado para 5,8. O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado (DIC),
com 5 tratamentos e 30 repetições por tratamento, onde
cada unidade experimental foi constituída por um tubo
de ensaio contendo uma semente. Aos 21 dias foram ava-
liados o número de sementes germinadas (após emissão
Estabelecimento in vitro de Ceiba rubriflora Carv.-Sobr. e L. P. Queiroz: uma espécie endêmica do vale do rio São Francisco
3
Cad. Ciênc. Agrá., v. 12, p. 01–05, https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.24029
da radícula) e de plântulas sobreviventes; o número de
sementes com contaminação fúngica e bacteriana.
Na etapa de multiplicação in vitro, após a germi-
nação, brotações apicais foram excisadas das plântulas de
C. rubriflora germinadas in vitro e inoculadas individual-
mente em tubos de ensaio contendo meio de cultura MS,
com pH ajustado para 5,8, suplementado com sacarose
(30,0 mg L
-1
), ágar (7,0 mg L
-1
) e 6-benzilaminopurina
(BAP) disposto em três tratamentos nas concentrações
de 0; 1,0 e 2,0 mg/L. O experimento de foi realizado em
delineado experimental inteiramente casualizado (DIC),
com 3 tratamentos e 15 repetições por tratamento, sen-
do a unidade experimental constituída por um tubo de
ensaio contendo um ápice meristemático. Após 21 dias
o experimento foi avaliado pela contagem do número de
brotações nos explantes apicais.
Em ambos os experimentos, os tratamentos foram
mantidos em câmara de crescimento por 21 dias, com
fotoperíodo de 16 horas, na temperatura de 25±2°C, sob
densidade média de fluxo de fótons de 26±2 µmol m
-2
s
-1
, obtidas por lâmpadas brancas fluorescentes.
Os dados mensurados foram submetidos ao teste
de Hartley (p < 0,01) e de Lilliefors (p < 0,01) previa-
mente à análise de variância (ANOVA, p < 0,01) a 1%
de probabilidade de erro, sendo as médias comparadas
através de um gráfico de barras.
Cultivo in vitro de C. rubriflora
O estabelecimento in vitro das sementes de C.
rubriflora com a desinfestação com NaOCl demonstrou
ser um procedimento eficiente, com 98% de germinação,
considerando todos os tratamentos, demonstrando que a
ação do cloro ativo sobre as sementes não compromete
sua germinação (FIGURA 1).
Figura 1 – Etapas do estabelecimento in vitro de sementes e desenvolvimento in vitro de plântulas de Ceiba rubriflora.
(A) Semente inoculada em meio MS; (B) Emissão da radícula; (C) Plântula desenvolvida; Brotações apicais
de C. rubriflora no meio de multiplicação in vitro com formação de raízes adventícias (D) e de calos na região
basal nos tratamentos com 1,0 mg L
-1
(E) e 2,0 mg L
-1
(F) de BAP, após 30 dias de cultivo in vitro. Barras =
1 cm.
Não houve diferença entre estes quanto a sobre-
vivências das plântulas, após 21 dias de cultivo in vitro.
No entanto, nem todas as sementes que germinaram
completaram seu desenvolvimento, após emissão de ra-
dícula. No presente estudo, a sobrevivência de plântulas
foi superior a 50% para todos os tratamentos (FIGURA
2), indicando que as sementes C. rubriflora coletados de
frutos ainda fechados não necessitam de tratamento de
desinfestação.
Ademais, a desinfestação das sementes é eficien-
te mesmo em concentrações baixas, inferior ou igual a
0,5% de cloro ativo, visto que as plântulas germinadas
in vitro não apresentaram contaminação bacteriana e a
taxa de contaminação fúngica total foi de apenas 2%.
Tal resultado, pode estar correlacionado ao fato de as
sementes terem sido obtidas de frutos imaturos, antes
da sua deiscência. Lazarotto et al (2010) afirmam que
a contaminação das sementes e frutos de essências flo-
restais ocorre predominantemente no solo, onde são
colonizados por diversos fungos. A qualidade sanitária
de sementes de espécies florestais tem papel importante
na sua germinação, devido a ocorrência de perdas por
deterioração e lesões ao embrião, o que enfatiza a impor-
tância de tratamentos de assepsia eficazes (Lazarotto et
al., 2011). Portanto, atrelado ao tratamento de assepsia,
a adoção de práticas que minimizem a contaminação das
sementes, como a coleta do fruto antes da sua queda e
deiscência, além do armazenamento laboratorial, pode
ser decisiva para o sucesso do estabelecimento in vitro.
O cultivo in vitro dos explantes apicais de C. ru-
briflora em meio de cultura suplementado com BAP não
proporcionou o desenvolvimento de novas brotações. A
dominância apical dos explantes e o fato de ter sido rea-
lizado um único cultivo in vitro, provavelmente, influen-
ciou na ausência de multiplicação de novas brotações.
Por sua vez, no tratamento isento de BAP, os explantes
apresentaram a formação de raízes adventícias (FIGURA
1D). Nos tratamentos com BAP, os explantes apresen-
taram a formação de calos em sua região basal, sendo
estes maiores na concentração de 2,0 mg L
-1
(FIGURA
Docha, A. L. M. et al.
4
Cad. Ciênc. Agrá., v. 12, p. 01–05, https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.24029
1E-F). O uso de outro regulador de crescimento com ação
citocínica, além de BAP, pode aumentar a proliferação
de brotações de C. rubriflora, conforme reportado para
C. pentandra com o uso das citocininas, BAP, cinetina
(CIN) e thidiazuron (TDZ) (Silva et al., 2010). Além
disso, a resposta calogênica dos explantes ao BAP pode
ser explicada pelo desequilíbrio no balanço endógeno
entre auxina e citocinina nos mesmos, acarretando um
desenvolvimento celular desorganizado, ou seja, formação
de calos (Takahashi, 2002). A literatura reporta que além
do uso de reguladores de crescimento no meio de cultura,
a retirada do meristema apical no primeiro subcultivo é
uma alternativa para a redução da dominância apical e
indução do desenvolvimento das brotações axilares dos
explantes (George et al., 2008; Stephin et al., 2019).
Figura 2 Valores médios da sobrevivência de plântulas de C. rubriflora nos tratamentos com hipoclorito de sódio
(NaOCl) nas concentrações de 0,0; 05; 1,0; 1,5 e 2,5 % de cloro ativo na desinfestação das sementes no
estabelecimento in vitro. Barras indicam o desvio padrão da média.
Os resultados apresentados neste estudo repre-
sentam um avanço na micropropagação de C. rubriflora.
Demonstrando um esforço para desenvolver metodologias
de preservação e proteção desta espécie endêmica. Além
disso, novas perspectivas se abrem para o desenvolvi
-
mento de protocolos de propagação in vitro com fins de
obtenção de mudas de C. rubriflora em larga escala
Conclusão
O estabelecimento in vitro de sementes de C.
rubriflora a partir de tratamento de assepsia com NaOCl,
independente da concentração de cloro ativo, é eficiente.
A germinação in vitro total das sementes foi superior a
98% e com taxa de sobrevivência de plântulas superior a
50%. As concentrações de BAP não induziram brotações
a partir de explantes apicais de C. rubriflora em um único
cultivo.
Agradecimentos
A Professora Rúbia dos Santos Fonseca pela dis-
ponibilização dos frutos de C. rubriflora para a realização
do estudo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cien-
tífico e Tecnológico (CNPq) e à Pró-reitoria da Pesquisa
da UFMG pela concessão de bolsa de Iniciação Científica
à primeira autora.
Referências
Al-Khateeb, W., Bahar, E., Lahham, J.; Schroeder, D. 2013. Regeneration
and assessment of genetic fidelity of the endangered tree Moringa
peregrina (Forsk.) Fiori using Inter Simple Sequence Repeat (ISSR).
Physiol Mol Biol Plants, 19: 157–164. doi: https://doi.org/10.1007/
s12298-012-0149-z.
Almeida, L. M. S.; Morais, L. E.; Resende, C. F.; Braga, V. F.; Pereira, P. F.;
Silva, R. A. C; Peixoto, P. H. P. 2015. Micropropagation and acclimatization
of Aegiphila Verticillata Vell.: an endangered woody species. Revista
Árvore, 39: 305–314. doi: https://dx.doi.org/10.1590/0100-
67622015000200010.
Aragão, V. P. M.; Navarro, B. V.; da Silva, A. T.; Silveira, V.; Santa-
Catarina, C. 2018. Micropropagation of Cariniana legalis (Martius)
O. Kuntze, an endangered hardwood tree from the Brazilian Atlantic
Forest. Plant Cell Culture & Micropropagation, 13: 41–50. Disponível
em: http://pccm.ufla.br/index.php/plantcellculturemicropropagation/
article/view/116/60.
Brondani, G. E.; Oliveira, L. S. D.; Bergonci, T.; Brondani, A. E.; França,
F. A. M.; Silva, A. L. L. D.; Gonçalves, A. N. 2013. Chemical sterilization
of culture medium: a low cost alternative to in vitro establishment of
plants. Scientia Forestalis, 41: 257–264. Disponível em: https://www.
ipef.br/publicacoes/scientia/nr98/cap11.pdf.
Estabelecimento in vitro de Ceiba rubriflora Carv.-Sobr. e L. P. Queiroz: uma espécie endêmica do vale do rio São Francisco
5
Cad. Ciênc. Agrá., v. 12, p. 01–05, https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.24029
Carvalho-Sobrinho, J. G.; Queiroz, L. P. 2008. Ceiba rubriflora (Malvaceae:
Bombacoideae), a new species from Bahia, Brazil. Kew Bulletin, 63:
649–653. doi: http://dx.doi.org/10.1007%2Fs12225-008-9070-6.
George, E. F.; Hall, M. A.; De Klerk, G. J. (Ed.). 2008. Plant propagation
by tissue culture: volume 1. Springer Netherlands.
Lazarotto, M.; Muniz, M. F. B.; Santos, A. F. 2010. Detection, transmission,
pathogenicity and chemical treatment of fungi in Ceiba speciosa seeds.
Summa Phytopathologica, 36:134–139. doi: https://doi.org/10.1590/
S0100-54052010000200005.
Lazarotto, M.; Piveta, G.; Muniz, M. F. B.; Reiniger, L. R. S. 2011.
Adequação do teste de tetrazólio para avaliação da qualidade de
sementes de Ceiba speciosa. Semina: Ciências Agrárias, 32, 1243–1250.
doi: https://doi.org/10.5433/1679-0359.2011v32n4p1243.
Mahr, D. L. 2009. Some Succulent Trees of Bahia and Minas Gerais,
Brazil. Cactus and Succulent Journal, 81: 138–146. doi: https://doi.
org/10.2985/015.081.0308.
MMA - Ministério do Meio Ambiente. 2019. Caatinga. Disponível em:
https://www.mma.gov.br/biomas/caatinga.
Murashige, T.; Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and
bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15,
473–497. doi: https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.
Oliveira, L. S.; Brondani, G. E.; Batagin-Piotto, K. D.; Calsavara, R.;
Gonçalves, A. N.; Almeida, M. D. 2015. Micropropagation of Eucalyptus
cloeziana mature trees. Australian Forestry, vol. 78, 219–231. doi:
https://doi.org/10.1080/00049158.2015.1073211.
Pasqual, M.; Dutra, L. F.; Araujo, A. G.; Pereira, A. R. 2010. Prevenção
de Contaminações microbianas na cultura de células, tecidos e órgãos
de plantas. 61–161. In: Scherwinski-Pereira, J.E. (Ed.). Contaminações
microbianas na cultura de células, tecidos e órgãos de plantas. Embrapa
Informação Tecnológica, Brasília, DF, Brasil: Embrapa Informação
Tecnológica.
REFLORA - Flora do Brasil 2019 em construção. Jardim Botânico do
Rio de Janeiro. Disponível em: http://floradobrasil.jbrj.gov.br/.
Silva, P. P.; Contim, L. A. S.; Freitas, D. V.; Aride, P. H. R.; Santos, A. L.
W. 2010. Estabelecimento in vitro de ápices caulinares de sumaúma
(Ceiba pentandra L. Gaertn). Scientia Agraria, 11: 437–443. doi: http://
dx.doi.org/10.5380/rsa.v11i6.20389.
Stephin, S., Gangaprasad, A., Mathew, S.P. 2019. Enhanced in vitro
shoot multiplication of Piper sarmentosum by suppression of apical
dominance. Proceedings of the National Academy of Sciences, India
Section B: Biological Sciences, 89: 1–8. doi: https://doi.org/10.1007/
s40011-019-01086-w.
Takahashi, E. K. Transferência do gene atacina A para plantas de maracujá
amarelo (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg.) por biobalística.
2002. Tese Doutorado. Piracicaba: Universidade de São Paulo, 137f.
Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/
tde-03122002-083637/.
Wu, K., Zeng, S., Lin, D., da Silva, J. A. T., Bu, Z., Zhang, J., & Duan,
J. 2014. In vitro propagation and reintroduction of the endangered
Renanthera imschootiana Rolfe. Plos One, 9: e110033. doi: https://
doi.org/10.1371/journal.pone.0110033.