Análise da presença da atividade da enzima alfa-amilase salivar na espécie bovina
Natan Dias de Oliveira
1
*; Anne Karoline Mendes da Silva
2
;
Valéria Magro Octaviano Bernis
3
; Walter Octaviano
Bernis Filho4
DOI: https://doi.org/10.35699/2447-6218.2021.26074
Resumo
A principal enzima salivar responsável pela digestão dos carboidratos é a alfa-amilase. Entretanto, estudos sobre a presença
desta enzima em bovinos são escassos e as vezes contraditórios. Diante disso, o objetivo dessa pesquisa foi verificar a presença
da atividade da enzima alfa-amilase em bovinos. O método usado para a determinação da enzima foi o colorimétrico
modificado, utilizando para tal o kit comercial “Amilase Colorimétrica K003” ( Bioclin, Quibasa Química Básica Ltda, Belo
Horizonte, MG, Brasil). A análise foi realizada mediante a visualização macroscópica da coloração após a amostra ser
incubada com o substrato amido, e pela adição do iodo; o amido não hidrolisado adquire coloração azul/preta que diminui
proporcionalmente à atividade enzimática, sendo comparado com um controle. Observou-se que nenhuma amostra
apresentou resultados colorimétricos que apontam a presença da alfa amilase, sendo assim possível sugerir que, não há
presença significativa desta proteína na saliva de bovinos que seja capaz de hidrolisar o amido.
Palavras-chave:
Amido. Bovino. Enzima digestiva. Glândula salivar.
Analysis of the presence of the activity of the salivary alpha-amylase enzyme in bovine
species
Abstract
The main salivary enzyme responsible for carbohydrate digestion is alpha-amylase. However, researches on the pre- sence of
this enzyme in bovine species are minimal and contradictory. Accordingly, the aim of this investigation was to analyze the
presence of alpha-amylase enzyme activity in the saliva in bovine species. The protocol used to determine the enzyme was the
modified colorimetric kit “Amilase Colorimétrica K003” (Bioclin, Quibasa Química Básica Ltda, Belo Horizonte, MG,
Brazil). The analysis was performed through macroscopic visualization of the staining after the sample was incubated with the
starch substrate, and when adding iodine, not hydrolyzed starch acquires blue/black coloration that decreases proportionally to
the enzymatic activity, being compared with a control. It was observed that no sample presented colorimetric results that
indicate the presence of the alpha amylase, being possible to conclude that, there is no significant presence of these protein in the
saliva of bovine species that be able to hydrolize the starch.
Keywords:
Starch. Enzymatic activity. Bovine. Salivary gland.
Recebido para publicação em 31 de outubro de 2020. Aceito para publicação em 10 de março de 2021
e-ISSN: 2447-6218 /
ISSN: 2447-6218. Atribuição CC BY.
CADERNO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
Agrarian Sciences Journal
2
Oliveira, N. D. et al.
Introdução
O homem e os ruminantes têm dividido uma longa
história de produção desde o início dos tempos,
inicialmente de uma forma nômade, e agora com mo-
dernas formas de manejo, principalmente no aspecto
nutricional. Assim, com a constante evolução da nutrição
nesta
espécie, o interesse sobre a digestão de bovinos tem
aumentado amplamente (Berchielli; Pires; Oliveira, 2011).
em animais são escassos e contraditórios entre literaturas
(Almeida, et al., 2008)
Alguns estudos afirmam a ausência da enzima
alfa- amilase salivar em bovinos adultos ou bezerros
(Young e Schneyer, 1981; Lima, et al., 2013), porém,
outros autores demonstraram a atividade da enzima alfa-
amilase salivar na mesma espécie (Reece, 2017; Alves,
Costa e Moraes, 2016). Nesse contexto, o objetivo desse
trabalho foi analisar a presença ou ausência da atividade da
enzima alfa-amilase na saliva de bovinos e que este trabalho
possa contribuir para estudos futuros sobre digestão dos
ruminantes.
A nutrição de ruminantes, em sua maioria, está
baseada nas pastagens tropicais, contudo, visto o inade-
quado manejo do pasto e a sazonalidade nos períodos de
seca,
torna-se necessário buscar alternativas para suprir as
exigências dos animais e, consequentemente, obter um
produto final de qualidade. O uso de concentrados, seja ele
com suplemento ou no próprio confinamento, são opções
para atender essas exigências, porém, a ne-
cessidade de
aumentar a densidade energética das dietas
maximiza o uso
desses concentrados, podendo acarretar distúrbios
metabólicos (Alves, et al., 2003).
Material e métodos
Coleta de amostras
Para este estudo foram analisadas amostras de
saliva oriundas de animais da Unidade Educativa de Pro-
dução de Zootecnia III do Instituto Federal do Norte de
Minas Gerais (IFNMG) – Campus Salinas, localizado na
Fazenda Varginha, Rodovia MG-404, Km 02, Salinas-MG. O
protocolo experimental desse trabalho foi aprovado pela
Comissão de Ética na Utilização dos Animais (CEUA) do
Instituto Federal do Norte de Minas Gerais sob o protocolo
de
número 06/2020.
Os problemas digestivos são frequentes em bo-
vinos e, na sua maioria, estão relacionados a um inade-
quado manejo nutricional, seja pelo fornecimento de
nutrientes em excesso como já dito, principalmente em
sistemas intensivos de criação, ou devido ao fornecimento
de
alimentos em quantidade ou qualidade inadequada, situação
mais observada em sistemas extensivos de cria- ção em
condições de escassez de forragens (Lima, et al. 2008,
Gheller, et al. 2010, Burns, et al. 2013).
Foram coletadas treze amostras, onde oito bovi- nos,
fêmeas adultas e em lactação estavam alimentadas com dieta
balanceada, e as outras cinco amostras de bezerros
lactentes. A dieta balanceada era constituída por 55% de
milho, 38% de farelo de soja, 2% de ureia,
3,5% de
suplemento mineral, 1% de óleo mineral e 0,5%
de
bicarbonato de sódio.
A maior parte dos componentes das dietas, in-
cluindo os carboidratos, são demasiadamente grandes para
sofrerem absorção direta através do epitélio intesti- nal e no
sangue. Dessa forma, é necessário que ocorra o processo de
digestão, que é onde ocorre a decomposição do alimento em
pequenos fragmentos (Reece, 2017).
A coleta da saliva foi realizada após a ordenha,
tanto de adultas como lactantes devido a facilidade de
contenção e manejo dos animais. Com o auxílio de luvas e
swab do tipo zaragatoa, as amostras foram coletadas do
vestíbulo oral dos animais através de um esfregaço (todas
em um mesmo dia, no período da tarde) (Figu- ra 1).
Durante a coleta, foram preenchidas fichas que continham
as identificações por brinco, sexo e tipo de alimentação
(Tabela 1).
Essa redução física da partícula é importante não
apenas para permitir que o alimento flua por um tubo
digestivo relativamente estreito, mas também para
aumentar a
área de superfície das partículas de alimento,
facilitando o
contato das enzimas digestivas que agem clivando
moléculas maiores em moléculas menores ca- pazes de
serem absorvidas (Klein, 2014).
O swab foi inserido em microtubo tipo eppendorf
(tubo de microcentrífuga – Figura 2) para a deposição da
saliva. Os microtubos se encontravam identificados e com 2
mL de solução fisiológica estéril (NaCl 0,9%).
Posteriormente, o material coletado foi acondicionado em
caixa de isopor com gelo (Figura 2), para serem conduzidas
ao laboratório e armazenadas em freezer de geladeira e
mantidas congeladas a -10°C, para posterior determinação da
presença da atividade da enzima alfa-
-amilase salivar.
Dentre as enzimas estudadas no processo diges-
tivo,
podemos citar a alfa-amilase salivar e a alfa-amilase
pancreática, que possuem importante participação na
digestão de carboidratos. Durante a digestão, os amidos
da
dieta começam a ser clivados na boca pela alfa-amilase salivar
(Reece, 2017). Essa enzima tem como função bio- lógica
dividir o amido em maltose, maltotriose e dextrinas
entretanto,
estudos sobre a presença de amilase salivar
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Análise da presença da atividade da enzima alfa-amilase salivar na espécie bovina
Figura 1 – Coleta de saliva através de esfregaço com swab no vestíbulo oral. (Fonte: arquivo da pesquisa)
Figura 2 – Microtubos tipo eppendorf identificados e com 2,0 mL de solução de NaCl 0,9%. (Fonte: arquivo da pesquisa)
Tabela 1 – Identificação dos animais que foram coletadas as amostras. (Fonte: dados da pesquisa)
Bovino/amostra
Identificação do brinco
Sexo
Alimentação
B01
B02
B03
B04
B05
B06
B07
B08
B09
b10
b11
b12
b13
8509-12
7801
061
8802-13
081
085
0210-10
080
6009-19
8806-19
7809-19
8107-19
0210-19
Fêmea
Fêmea
Fêmea
Fêmea
Fêmea
Fêmea
Fêmea
Fêmea
Macho
Fêmea
Macho
Fêmea
Fêmea
Dieta balanceada
Dieta balanceada
Dieta balanceada
Dieta balanceada
Dieta balanceada
Dieta balanceada
Dieta balanceada
Dieta balanceada
Lactente Lactente
Lactente Lactente
Lactente
Em que: B: Vacas em Lactação; b: Bezerros lactentes
Análise laboratorial
Atendimento Clínico Veterinário do mesmo campus. Os
microtubos tipo eppendorf foram retirados do freezer e
deixados para descongelar em temperatura ambiente.
As análises foram feitas 24 horas após a cole- ta,
sendo conduzidas em laboratório do Complexo de
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Oliveira, N. D. et al.
Após o descongelamento, os tubos foram homogeneizados
para
a realização das análises.
saliva é incubada com o substrato amido (Reagente nº 1) e
aquecida em temperatura de 38,6°C, durante dois minutos,
para simular a temperatura média do corpo de um bovino.
Pela adição da solução iodada (Reagente nº
2), o amido ainda
não hidrolisado, adquire coloração azul
que diminui
proporcionalmente à atividade enzimática, sendo comparado
com um controle.
O protocolo usado foi o descrito no kit colori-
métrico específico (Amilase Colorimétrica K003, Bioclin,
Quibasa Química Básica Ltda, Belo Horizonte, MG, Brasil)
e
adaptado, sendo utilizado como base o método colori-
métrico modificado (Caraway, 1959), onde a amostra de
Figura 3 – Kit de reagentes para determinação colorimétrica da amilase. (Fonte: arquivo da pesquisa).
Para o controle foi utilizada uma amostra de saliva
humana. A saliva humana possui constante ativi- dade da
enzima digestiva alfa-amilase ( Hall, 2011). Foi realizado um
teste inicial com saliva humana, seguindo detalhadamente o
método inicial, validando a técnica empregada com o
aspecto de saliva reagente.
Os tubos tipo Falcon foram separados e identifica- dos
(Figura 4). Os tubos marcados com “B”, referem-se às
vacas
lactantes, e “b”, referem-se aos bezerros lactentes. Também
foi adicionado um tubo controle. Com base nas instruções do
kit colorimétrico, foram distribuídos 0,5 mL do reagente nº
1 em cada tubo, que foram mantidos por dois minutos em
banho-maria à 38,6°C.
Figura 4 – Tubos tipo Falcon devidamente identificados (Fonte: arquivo da pesquisa).
Ao serem retirados do banho-maria, foram adi-
cionados 10µL de cada amostra de saliva em cada tubo. O
controle não obteve nenhuma adição. Em seguida foram
homogeneizados e mantidos em banho-maria por sete
minutos e trinta segundos à 38,6°C. Após a retirada o tubo
foi adicionado 0,5 mL do reagente nº 2, e homoge- neizou-se.
A análise da presença da atividade da enzima
alfa-amilase salivar foi feita mediante a visualização
macroscópica da coloração da amostra obtida.
Resultados e discussão
Dos treze animais analisados oito eram animais
adultos e cinco eram filhotes, que possuíam fases de de-
senvolvimento e alimentação distintas. Observou-se que
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nenhuma amostra apresentou resultados colorimétricos
significativos da presença da atividade da enzima alfa-
-amilase salivar, possuindo a mesma coloração do teste
controle (Figura 6). Por meio da Figura 7, é evidente a
eficácia da metodologia pela análise que foi realizada
com
amostra salivar humana, reconhecidamente descrita
com a
presença desta enzima (Hall, 2011). O amido foi
hidrolisado
e deixou a amostra com coloração amarelada.
Figura 5 – Tubos com reagente Nº 1 sendo preparados e alocados em banho-maria. (Fonte: arquivo da pesquisa)
Os resultados obtidos corroboram com estudos de
Young e Schneyer (1981) e Andriguetto-Filho (2002) que
apontaram a ausência da atividade da enzima al- fa-amilase
salivar em bovinos adultos. Nos estudos de Lima, et al.
(2013), citam a ausência de amilase salivar em bezerros.
Conclusão
Com os resultados desse trabalho podemos con-
cluir
que, ao realizar a análise laboratorial dessas amostras
coletadas,
observa-se que não há presença significativa da alfa-amilase
na saliva de bovinos adultos ou jovens que seja capaz de
hidrolisar o amido.
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Oliveira, N. D. et al.
Figura 6 – Amostra com resultado negativo para a atividade da enzima. (Fonte: arquivo da pesquisa)
Figura 7 – Amostra de saliva humana hidrolisada. (Fonte: arquivo da pesquisa)
C
B
Em que: B: Amostra bovina não hidrolisada; C: Amostra humana hidrolisada
Aprovação do Comitê de Ética
do Norte de Minas Gerais sob o protocolo de número
06/2020.
O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética na
Utilização dos Animais (CEUA) do Instituto Federal
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