Comportamento de amoxicilina e clavulanato em pH alcalino de leite de vacas com mastite
Giovanna de Medeiros Guimarães1*, Leonardo Borges Acurcio2, Nayane Aparecida Moreira3, Bruno Henrique
Cabral4, Alessandra Vilano Goulart5
DOI: https://doi.org/10.35699/2447-6218.2022.40755
Resumo
O leite, um alimento nobre e de grande importância para a pecuária pode sofrer impactos negativos, em especial
com a ocorrência de doenças, como a mastite, que provoca alterações no pH, o que o deixa mais alcalino. A mastite
causada por Streptococcus uberis (S. uberis), um agente etiológico ambiental, tem como alvo tratamentos à base de ß-
lactâmicos, usualmente prolongado pela dificuldade no tratamento destas. Nesse sentido, sabe-se que o pH alcalino
hidrolisa os ß-lactâmicos em meios líquidos, assim, o objetivo do trabalho foi observar se o pH alcalino do leite de
vaca com mastite ambiental provoca inativação ou redução da ação dos antimicrobianos. Para tal, leite saudável e de
animais com mastite foram cedidos de uma propriedade rural em Córrego Fundo-MG onde nestes foram mensurados
o pH e realizado esterilização para inoculação de cepas de S. uberis (previamente isolado) juntamente com uma base
antimicrobiana comercial de amoxicilina e clavulanato. Ao final, foi verificado o crescimento bacteriano nas diferentes
amostras. Foi realizado um antibiograma com a amostra isolada de S. uberis para verificar a ausência de resistência
ao antimicrobiano utilizado, onde tal amostra não apresentava resistência. Dentro das condições experimentais, o
micro-organismo apresentou um comportamento de crescimento diferente diante dos diferentes pH das amostras,
crescendo mais (p<0,01) no leite de mastite com pH 7,6, mesmo na presença de antimicrobiano. Com isso, enfatiza-se
a necessidade da realização de mais estudos farmacológicos sobre os antimicrobianos utilizados na mastite.
Palavras-chave: Antimicrobianos. Mastite ambiental. Resistência bacteriana. S. uberis. Streptococcus.
Behavior of amoxicillin and clavulanate in alkaline pH of milk from cows with mastitis
Abstract
Milk, a noble food of great importance for dairy production can suffer negative impacts, especially with the occurrence
of diseases, such as mastitis, which causes changes in pH, which makes it more alkaline. Mastitis caused by Strepto-
coccus uberis (S. uberis), an environmental etiological agent, requires ß-lactam-based treatments, usually prolonged
due to the difficulty in treating them. In this sense, it is known that the alkaline pH hydrolyses ß-lactams in liquid
media, thus, the objective of this study was to observe whether the alkaline pH of cow’s milk with environmental
mastitis causes inactivation or reduction of antimicrobial action. For this purpose, healthy milk and animals with
mastitis were transferred from a rural property in Córrego Fundo-MG, where the pH was measured and sterilization
was performed for inoculation of S. uberis strains (previously isolated) together with a commercial antimicrobial base
of amoxicilline and clavulanato. At the end, bacterial growth was verified in all different samples. An antibiogram was
performed with the isolated sample of S. uberis to verify the absence of antimicrobial resistance, where the sample did
1Centro Universitário de Formiga - UNIFOR - MG. Formiga, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0001-9007-8220
2Centro Universitário de Formiga - UNIFOR - MG. Formiga, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0002-2981-5479
3
Centro Universitário de Formiga - UNIFOR - MG. Formiga, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0003-2290-5065
4
Centro Universitário de Formiga - UNIFOR - MG. Formiga, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0001-7069-6486
5
Centro Universitário de Formiga - UNIFOR - MG. Formiga, MG. Brasil.
https://orcid.org/0000-0001-6007-6072
*Autor para correspondência: giovannamedeiros64@gmail.com
Recebido para publicação em 26 de agosto 2022. Aceito para publicação em 15 de novembro de 2022.
e-ISSN: 2447-6218 / ISSN: 2447-6218. Atribuição CC BY.
CADERNO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
Agrarian Sciences Journal
2
Guimarães, G. de M. et al.
Cad. Ciênc. Agrá., v. 14, p. 01–05, DOI: https://doi.org/10.35699/2447-6218.2022.40755
not present resistance. Within the experimental conditions, the microorganism showed a different growth behavior
in view of the different pH of the samples, growing more (p
<
0,01) in mastitis milk with pH 7,6, in antimicrobial
presence. Thus, it is emphasized the need for further pharmacological studies regarding antimicrobials use in mastitis.
Keywords: Antimicrobials. Bacterial resistance. Environmental mastitis. S. uberis. Streptococcus.
Introdução
O leite é um alimento nobre e completo, pois é
composto por água, proteínas, gorduras, carboidratos,
vitaminas e sais minerais, sendo um dos produtos de
origem animal que movimenta o setor agroindustrial,
representando uma importante forma de produção da
pecuária brasileira.
Por sua importância econômica, cultural e social,
quaisquer alterações que afetem a sua produção podem
ser um problema dentro de propriedades rurais. Nesse
contexto, a mastite aparece como importante causadora
de impacto negativo nos rebanhos leiteiros (Santos et al.,
2017).
A mastite, em especial a ambiental, é normal-
mente causada por bactérias oportunistas que estão em
diversos locais, como o curral de ordenha, chão e, prin-
cipalmente, em matérias orgânicas, como as fezes dos
animais, se alojando, por exemplo, nas camas em sistemas
de confinamento (Silva; Primieri, 2020). Massote et al.
(2019) explicam que a contaminação dos tetos pode
ocorrer mais comumente na cama dos animais.
Entre os agentes causadores da mastite ambien-
tal, destaca-se o Streptococcus uberis (S. uberis), um coco
Gram
+,
presente na microbiota indígena e no ambiente
de, sendo um importante agente causador de mastite
(Langoni et al., 2017). De forma geral, bactérias como
essa em questão respondem bem aos tratamentos à base
de ß-lactâmicos (Duarte et al., 2019).
No entanto, existem cerca de 70 cepas deste mi-
cro-organismo com uma grande variabilidade genética,
onde algumas destas cepas podem apresentar também
um caráter contagioso, podendo ser transmitidas para
outros animais durante a ordenha, além de poder evoluir
facilmente para as formas subclínica e crônica, se tornando
assim um patógeno de complexo tratamento (Massote et
al., 2019; Ulsenheimer et al., 2021). Assim, na maioria
das vezes, o tratamento recomendado pelo bulário dos
antimicrobianos utilizados na mastite não é eficaz, sendo
necessário prolongar o uso dos antimicrobianos em até
oito dias (Langoni et al., 2017; Massote et al., 2019).
Além disso, muitas das vezes ocorre a interrup-
ção do uso de antimicrobianos antes do recomendado,
pelo fato do animal apresentar uma cura clínica, ou seja,
visualmente não apresenta mais sintomas de mastite
(Ribeiro, 2008). Porém, isso não quer dizer que o animal
apresenta uma cura bacteriológica, sendo assim, mesmo
sem sintomatologia clínica, o animal ainda pode possuir
a bactéria presente no seu organismo, onde, numa inter-
rupção de tratamento,o uso de antimicrobiano apenas
por alguns dias se torna um grande problema de saúde
animal e, possivelmente, de saúde pública no contexto
da saúde única, por provocar resistência bacteriana e
deixar os recursos antimicrobianos ainda mais escassos
(Duarte et al., 2019; Massote et al., 2019; Pisseti et al.,
2021, Ribeiro, 2008).
Sabe-se então que a resistência bacteriana é um
problema, uma vez que quando ela existe, a bactéria em
questão passa a não ser mais sensível a determinado an-
timicrobiano e, por isso, a utilização de antimicrobianos
de forma inadequada no tratamento da mastite, além
de não resolver o problema, pode agravar a resistência
(Pisseti et al., 2021). Por isso, para evitar impasses como
estes, identificar outras possíveis formas de inativação e
potencial resistência dos micro-organismos aos antimi-
crobianos é essencial.
Nesse contexto, cabe também ressaltar que a
mastite provoca alterações físico-químicas no leite, fa-
zendo com que ocorra perda de 20% de caseína e 15%
de gordura, modificação de íons (aumento de Na+ e Cl-,
com diminuição de Ca++) e alterações enzimáticas que
podem prejudicar o leite e os seus derivados (Massote
et al., 2019; Santos et al., 2017). Sabe-se que também
ocorre, em especial, a alcalinização do pH, isso porque a
vaca com mastite libera histamina em resposta à infecção
e, assim, a histamina deixa os capilares mais permeáveis
à passagem de células e componentes sanguíneos, que
por sua vez tem um pH ligeiramente alcalino, deixando
assim o leite com propriedades parecidas (Massote et al.,
2019; Santos et al., 2017; Silva; Primieri, 2020).
Com base no exposto, é de conhecimento que
os meios líquidos alcalinizados podem provocar hidró-
lise de ß-lactâmicos (Sá et al., 2018; Silva et al., 2013)
e que variações de pH no leite com mastite ocorrem,
deixando-o mais alcalino (Santos et al., 2017). Assim, o
objetivo deste trabalho foi observar se o pH alcalino do
leite de vaca com mastite ambiental provoca inativação
ou redução da ação dos antimicrobianos
Materiais e métodos
Foram cedidas três amostras de leite por uma
propriedade rural da região de Córrego Fundo-MG. Es-
sas amostras continham leites saudáveis e de vacas com
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mastite, sendo algumas das amostras com mastite re-
tiradas de animais separadamente (mastite), e outras
retiradas de um tanque contendo apenas leite de vacas
com mastite (tanque). Todas foram refrigeradas (< 7ºC)
e transportadas em recipientes estéreis até sua análise
no Laboratório de Microbiologia do UNIFOR-MG. Todo o
trabalho foi realizado com três repetições em triplicata.
Também foi fornecido pela mesma propriedade
rural placas de OnFarm® (Piracicaba, SP, Brasil) contendo
a identificação microbiológica de Streptococcus uberis,
sendo o causador de mastite dos leites coletados.
Foi medido o pH de todas as amostras com um
pHmetro portátil (Kasvi K39-0014PA®, São José dos Pi-
nhais, PR, Brasil). Posteriormente, 100 mL de cada leite
foi esterilizado, por meio de autoclave, para garantir que
todos os leites possuam a mesma quantidade de micro-or-
ganismos inoculados. Assim, os leites foram inoculados
com S. uberis e acrescidos de antimicrobiano através de
uma bisnaga comercial para tratamento de mastite, com
a base de amoxicilina e clavulanato (em seringa de 8 g,
contendo Amoxicilina Trihidratada 200 mg, Clavulanato
de Potássio 50 mg, Acetato de Prednisolona 10 mg; Mas-
tite clínica VL® - J.A. Saúde Animal, Patrocínio Paulista,
SP, Brasil).
Para padronização do inóculo a colônia de
S.
uberis presente nas placas de SmartColor 2 da OnFarm®
(Piracicaba, SP, Brasil) foi coletada e ajustada em salina
estéril (NaCl 0,9 %) na turbidez de 0,5 de MacFarland
(~ 10
8
UFC) (Tanikawa-Vergilio, 2020).
Em 100 mL de leite saudável e com mastite (tan-
que e vaca), já esterilizados, foram colocados 3 mL da
solução salina com o inoculo e, juntamente, foi acrescido a
quantidade de 0,1 g de amoxicilina e clavulanato. Os leites
já inoculados com o micro-organismo e antimicrobiano
foram refrigerados durante 8 horas. Assim, buscou-se
verificar se o pH alcalino do leite de vaca com mastite
influencia na ação da amoxicilina e clavulanato.
Após as oito horas, as amostras de leite novamente
passaram por medição de pH pelo método supracitado
e, posteriormente, foram plaqueadas em triplicata, na
diluição 10-2 e 10-3, no meio de cultura ágar BHI (Kasvi;
São José dos Pinhais, PR, Brasil), e incubadas por 24 horas
a 37°C (Silva et al., 2021). Após esse tempo foi quantifi-
cado o número de colônias presentes nas amostras, para
assim verificar se o pH alcalino do leite com mastite teve
alguma influência na menor ação dos antimicrobianos.
Por fim, as placas de crescimento positivo, do leite
esterilizado na diluição 10-3, passaram por um processo
de antibiograma, onde foi verificada a resistência ou
sensibilidade dos agentes microbianos à base de amo-
xicilina e clavulanato, por método de disco-difusão em
meio Müller-Hinton, sendo avaliado a susceptibilidade
do micro-organismo medindo-se o diâmetro dos halos de
inibição conforme proposto inicialmente por Bauer et al.
(1966) e preconizando-se os limites estabelecidos pelo
Clinical Laboratory and Standards Institute (CLSI, 2020).
Para a realização de todas as análises estatísticas
foi utilizado o programa GraphPad Prism 6.0 (GraphPad
Software, San Diego, Califórnia, EUA). O teste realizado
foi o teste de t Student não pareado. Foram considerados
estatisticamente significativos resultados que apresenta-
ram significância mínima de 5 % (p
<
0,05) entre si.
Resultados e discussão
O micro-organismo utilizado como inóculo não
apresentou resistência no teste de antibiograma à amo-
xicilina e clavulanato. Os leites inoculados com micro-
-organismo e antimicrobiano analisados apresentaram
os respectivos pH: leite saudável - 6,8; leite individual
de vaca com mastite vaca - 7,6 (identificado como: mas-
tite) e leite de um conjunto de vacas com mastite - 7,3
(identificado como: tanque).
O pH do leite de animal saudável e apropriado
para o consumo humano encontra-se entre 6,6 e 6,8,
enquanto o pH de leite de vaca com mastite, encontra-
-se levemente alcalino com valores acima de 7,2 (Silva;
Primieri, 2020).
Alguns autores afirmam que nos quadros de
mastite causadas por S. uberis, o tratamento realizado
durante o período de secagem apresenta resultados me-
lhores e provoca menor incidência de casos crônicos e
subclínicos (Langoni et al., 2017). Essa justificativa pode
ser explicada pelo fato de que o pH alcalino, presente
no leite de mastite das vacas em lactação, provocam
inativação de alguns antimicrobianos, como é o caso da
amoxicilina e clavulanato visto neste estudo (Figura 1).
Quando comparado o crescimento da amostra
microbiológica no leite de vaca saudável e no leite indivi-
dual de vaca com mastite, mediante a ação de amoxicilina
(200mg) e clavulanato (50mg), os resultados mostraram
influência do pH na inativação do antimicrobiano, tendo
em vista o menor crescimento (p<0,01) de S. uberis em
leite alcalino (pH 7,6). Resultados parecidos foram vistos
por Silva et al. (2013), que evidenciaram que antimicro-
bianos na presença de meio alcalinos não impediam o
crescimento de alguns micro-organismos.
A inativação de antimicrobianos, em especial
de ß-lactâmicos, realizada por hidrólise alcalina, é vista
em diversos estudos (Sá et al., 2018; Silva et al., 2013).
Isso ocorre porque o meio alcalino consegue mudar a
estrutura do anel dos ß-lactâmicos, o que faz com que
sejam modificadas não somente a estrutura da molécula,
como também sua polaridade, realizando a abertura do
anel, levando o antimicrobiano à perda ou redução da
sua função (Silva et al., 2013).
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Guimarães, G. de M. et al.
Cad. Ciênc. Agrá., v. 14, p. 01–05, DOI: https://doi.org/10.35699/2447-6218.2022.40755
Figura 1 – Crescimento de S. uberis em leite de vaca saudável (pH 6,8) e em leite individual de vaca com mastite (pH
7,6) na presença de amoxicilina (200mg) e clavulanato (50mg)
Legenda: **p<0,01 pelo teste t de Student.
Silva et al. (2013) também mostrou que a hi-
drólise alcalina ocorre aos poucos, ou seja, quanto maior
o tempo de ação do pH sobre o antimicrobiano, mais a
concentração do mesmo será reduzida. No caso do ß-lac-
tâmico amoxicilina e clavulanato, sua concentração pode
ser reduzida de 100% para 0,06% em duas horas, em
pH >11,0 (Silva et al. 2013). O tempo de inativação da
estrutura do anel ß-lactâmico também varia de acordo
com o pH da substância no qual este se encontra, onde
para a amoxicilina, quanto maior o pH, mais rápida essa
inativação ocorre (Sá et al., 2018).
Quando comparado o crescimento da amostra
microbiológica no leite saudável e no leite de um con-
junto de vacas com mastite (tanque), mediante a ação
de amoxicilina (200mg) e clavulanato (50mg), os resul-
tados mostraram que não houve influência significativa
do pH na ação do antimicrobiano, sendo visualizados
crescimentos similares em ambas as amostras (Figura 2).
Figura 2 – Crescimento de S. uberis em leite de vaca saudável (pH 6,8) e em leite de vaca com mastite no tanque (pH
7,3) na presença de amoxicilina (200mg) e clavulanato (50mg)
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Na propriedade deste estudo, o leite de todas as
vacas com mastite foi depositado em um tanque específico
para leite de descarte. Este resultado provavelmente se
deu em um contexto no qual o leite com pH menos alca-
lino incide em uma diferença de crescimento microbiano
não tão evidente assim. Essa menor alcalinidade pode ter
ocorrido pelo efeito de diluição do tanque. Resultados
diferentes foram vistos em Silva et al. (2013), onde, até
mesmo em substâncias com pH próximo da neutralida-
de, houve a hidrólise de antimicrobiano e o impacto no
crescimento do micro-organismo.
Sabe-se que a farmacocinética e a farmacodinâ-
mica de antimicrobianos para uso em glândula mamária
de animais com mastite são avaliadas, na maioria das
vezes, em animais saudáveis, o que impede de avaliar tais
aspectos diante de alterações na permeabilidade vascular
e dos componentes presentes no tecido alvo, como ocorre
na glândula mamária de animais com mastite (Duarte et
al., 2019; Langoni et al., 2017; Ribeiro, 2008). Assim,
uma menor eficácia do medicamento utilizado de forma
intramamária para a mastite pode estar sendo desconsi-
derada (Duarte et al., 2019; Pisseti et al., 2021).
Considerações finais
Nas condições deste estudo notou-se que, em
decorrência do pH alcalino do leite individual de vacas
com mastite, a presença do antimicrobiano amoxicilina
(200mg) e clavulanato (50mg) foi menos eficaz (p<0,01)
no controle do crescimento do agente etiológico ambiental
causador de mastites, quando comparado ao crescimento
em leite de vaca saudável. Com isso, enfatiza-se a necessi-
dade da realização de mais estudos farmacológicos sobre
os antimicrobianos utilizados na mastite, mesmo os que
já se encontram no mercado, para que seja garantido um
pH correto de absorção do medicamento e o tempo de
aplicação entre doses seja eficiente. Logo, o tratamento
ideal para mastite precisa considerar não somente fatos
como cura clínica e bacteriológica da doença, mas também
os impasses pontuados no trabalho em questão.
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