Padronização de método baseado em PCR e sequenciamento para detecção da presença do gene CP4 EPSPS em Zea mays

Autores

DOI:

https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.19990

Palavras-chave:

Organismos geneticamente modificados, MON8807, Detecção, Milho

Resumo

O plantio de cultivares transgênicas no Brasil e no mundo tem crescido e demandado regulamentação legal. O evento transgênico MON8807 é frequentemente encontrado em cultivares de milho comercializadas no Brasil. Esse evento contém em sua construção os genes CP4 EPSPS e Cry3Bb1 que codificam, respectivamente, a tolerância ao herbicida glifosato e resistência a lagartas.  Metodologias que permitam o rastreamento de eventos transgênicos são globalmente mandatórias. O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia baseada em PCR qualitativo e sequenciamento para detecção do gene CP4 EPSPS em Zea mays. Para tal linhagens comerciais de milho transgênico contendo o evento MON88017 e milho convencional foram submetidas ao procedimento de extração de DNA. Foram desenhados oligonucleotídeos para detecção parcial dos genes zeína e CP4 EPSPS. A reação de PCR para detecção das regiões parciais dos genes CP4 EPSPS e Zeína (como marcador endógeno da espécie Z. mays) foi então realizada. As três linhagens transgênicas de milho testaram positivo para os gene Zeína e CP4 EPSPS, bem como as duas linhagens convencionais testaram negativo para CP4 EPSPS e positivas somente para o gene zeína. A confirmação da presença das regiões gênicas, os produtos de PCR foram sequenciados e apresentaram 100% de identidade com sequência dos genes Zeína e CP4 EPSPS depositados no GenBank. Os resultados deste trabalho sugerem a aplicabilidade de um método “in house” para detecção qualitativa do gene CP4 EPSPS em cultivares de milho geneticamente modificado.

Biografia do Autor

  • Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira Xavier, Universidade Estadual de Montes Claros. Montes Claros,MG. Brasil.

    Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Goiás (1996), doutorado em Ciências Biológicas (ênfase em Biologia Molecular) pela Universidade de Brasília (2006) e pós- doutorado em Ciências Agrárias pela Universidade Federal de Minas Gerais (2015). Como bióloga atuou no Controle de Qualidade Microbiológico da Novo Nordisk Produção Farmacêutica do Brasil. Tem experiência na área de Microbiologia, com ênfase em Microbiologia Aplicada à Indústria Farmacêutica, atuando principalmente nos seguintes temas: Validação de métodos analíticos microbiológicos, Escrita de procedimentos operacionais, Ministração de treinamentos em métodos analíticos microbiológicos, Qualificação de equipamentos de laboratório e Identificação de Micro-organismos por métodos tradicionais e rápidos. Possui experiência em docência no ensino superior (em metodologias tradicionais e ativas dentre as quais aprendizagem baseada em problemas), atuando principalmente em ensino e pesquisa nas áreas de Microbiologia e Biologia Molecular ou a ela relacionadas. Já foi membro do comitê de validação na Novo Nordisk, bem como diretora de pesquisa e membro do comitê de ética em pesquisa nas Faculdades Unidas do Norte de Minas. Desde 2007 atua como docente do curso de graduação em Medicina na Universidade Estadual de Montes Claros.A partir de 2011 tornou-se membro do corpo docente permanente do Mestrado Profissional em Biotecnologia da Universidade Estadual de Montes Claros onde além de orientar estudantes participa como professora das disciplinas: Biologia Molecular, Microbiologia Industrial, Qualidade no Segmento Biotecnógico e Tecnologia de Produção de Proteínas Recombinantes. Coordenadora do laboratório de ensino de MIcrobiologia - Unimontes

     

Referências

Abdel-Latif, A.; G. Osman. 2017. Comparison of three genomic DNA extraction methods to obtain high DNA quality from maize. Plant Methods, 13: 1–9. Doi: https://doi.org/10.1186/s13007-016-0152-4.

Anklam, E.; Gadani, F.; Heinze, P.; Pijnenburg, H.; Den Van Eede, G. 2002. Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products. European Food Research and Technology, 214: 3–26. Doi: https://doi.org/10.1007/s002170100415.

Brasil – CIB - Conselho de informações sobre biotecnologia. 2010. MON88017 (YieldGard VT Rootworm/RR2). Retrieved on April 04, 2019 from: https://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=94

Brasil – MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. 2003. Decreto No. 4.680/2003: 1–2.

Broeders, S. R. M.; De Keersmaecker, S. C. J.; Roosens, N. H. C. 2012. How to Deal with the Upcoming Challenges in GMO Detection in Food and Feed. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012: 1-11. Doi: https://doi.org/10.1155/2012/402418

Campos, L. F. L.; Silva, A. N. M.; David,M. E. D. dos Santos, J.; Cangussu, C. H. C.; Xavier, M. A. S.; Xavier, A. R. E. O. 2018. Eficiência de métodos de extração de DNA de tecido foliar de espécies transgênicas de Glycine max e Zea mays. Retrieved on April, 03, 2019. From: http://www.fepeg2018.unimontes.br/anais/download/3324f215-d852-4a8c-8992-b47182cce712

Cardarelli, P.; Branquinho, M. R.; Ferreira, R. T. B.; da Cruz, F. P.; Gemal, A. L. 2005. Detection of GMO in food products in Brazil: the INCQS experience. Food Control, 16: 859–866. Doi: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2004.07.010.

Cardoso, L.; Cangussu, C. H. C.; Nogueira, H. S.; dos Santos, J.; Xavier, M. A. S.; de Oliveira, A. M. E.; Albuquerque, C. J. B.; Xavier, A. R. E. O. 2018. Métodos baseados na detecção de DNA para rastreamento de modificações genéticas em cultivares transgênicos de milho e soja. Caderno de Ciências Agrárias, 9: 101–114. [online]. Acesso em 24/04/2020. Disponível em: https://pdfs.semanticscholar.org/7e54/34bb0f28066273f5aaf8e37a27f7ba3efbe3.pdf.

Conceição, F. R.; Moreira, A. N.; Binsfeld, P. C. 2006. Detecção e quantificação de organismos geneticamente modificados em alimentos e ingredientes alimentares. Ciência Rural, 36: 315-324. Doi: https://doi.org/10.1590/S0103-84782006000100053.

Cruz, J. C.; Pereira-Filho, I. A.; Borghi, E.; Simão, E. P. 2015. Quatrocentas e setenta e sete cultivares de milho estão disponíveis no mercado de sementes do Brasil para a Safra 2015/16. Embrapa Milho e Sorgo, 1: 1–29. [online]. Acesso em 24/04/2020. Disponível em: https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/1038512/1/doc184.pdf

Dinon, A. Z.; Prins, T. W.; Van Dijk, J. P.; Arisi, A. C. M.; Scholten, I. M. J.; Kok, E. J. 2011. Development and validation of real-time PCR screening methods for detection of cry1A.105 and cry2Ab2 genes in genetically modified organisms. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 400: 1433–1442. Doi: https://doi.org/10.1007/s00216-011-4875-9.

Doyle, J. J.; Doyle, J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12: 13-15.

Forte, V. T.; Di Pinto, A.; Martino, C.; Tantillo, G. M.; Grasso, G.; Schena, F. P. 2005. A general multiplex-PCR assay for the general detection of genetically modified soya and maize. Food Control, 16: 535–539. Doi: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2004.05.010.

Fraiture, M. A.; Herman, P.; Taverniers, I.; De Loose, M.; Deforce, D.; Roosens, N. H. 2015. Current and new approaches in GMO Detection: challenges and solutions. Biomed Research International, 2015: 1–22. Doi: http://dx.doi.org/10.1155/2015/392872.

Gašparič, M. B.; Tengs, T.; La Paz, J. L.; Holst-Jensen, A.; Pla, M.; Esteve, T; Zel, J.; Gruden, K. 2010. Comparison of nine different real-time PCR chemistries for qualitative and quantitative applications in GMO detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 396: 2023–2029. Doi: https://doi.org/10.1007/s00216-009-3418-0.

Germini, A.; Zanetti, A.; Salati, C.; Rossi, S.; Forre, C.; S. Schmid, S.; Fogher, C.; Marchelli, R. 2004. Development of a seven-target multiplex PCR for the simultaneous detection of transgenic soybean and maize in feeds and foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 3275–3280. Doi: https://doi.org/10.1021/jf035052x.

Heck, G. R.; Armstrong, C. L.; Astwood, J. D.; Behr, C. F.; Bookout, J. T.; Brown, S. M.; You, J. 2005. Development and characterization of a CP4 EPSPS-based, glyphosate-tolerant corn event. Crop Science, 45: 329-339. Doi: https://doi.org/10.2135/cropsci2005.0329.

Heide, B. R.; Heir, E.; Holck. A. 2008. Detection of eight GMO maize events by qualitative, multiplex PCR and fluorescence capillary gel electrophoresis. European Food Resesarch and Technology, 227: 527-535. Doi: https://doi.org/10.1007/s00217-007-0751-4.

Hernández, M.; Rodríguez-Lázaro, D.; Esteve, T.; Prat, S.; Pla, M. 2003. Development of melting temperature-based SYBR™Green I polymerase chain reaction methods for multiplex genetically modified organism detection. Analytical Biochemistry, 323: 164–170. Doi: https://doi.org/10.1016/j.ab.2003.07.015.

Höhne, M.; Santisi, C. R.; Meyer, R. 2002. Real-time multiplex PCR: an accurate method for the detection and quantification of 35S-CaMV promoter in genetically modified maize containing food. European Food Research and Technology, 215: 59-64. Doi: https://doi.org/10.1007/s00217-002-0503-4

Holst-Jensen, A., S. B. Rønning, A. Løvseth and K. G. Berdal. 2003. PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs). Analyticaland Bioanalytical Chemistry 375: 985–93. [online]. Acesso em 24/04/2020. Disponível em: https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/s00216-003-1767-7.pdf

Holst-Jensen, A., Y. Bertheau, M. de Loose, L. Grohmann, S. Hamels, L. Hougs, D. Morisset, S. Pecoraro, M. Pla, M. Van den Bulcke and D. Wulff. 2012. Detecting un-authorized genetically modified organisms (GMOs) and derived materials. Biotechnology Advances, 30: 1318–35. Doi: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2012.01.024

ISAAA, 2018. Event Name: MON88017. Retrieved on April, 04, 2019. From: <http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=94>.

James, D.; Schmidt, A. M.; Wall, E.; Green, M.; Masri, S. 2003. Reliable detection and identification of genetically modified maize, soybean and canola by multiplex PCR analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51: 5839–5834. Doi: https://doi.org/10.1021/jf0341159

Kim, J. H.; Song, H. S.; Heo, M. S.; Lee, W. Y.; Lee, S. H.; Park, S. H.; Park, H. K.; Kim, M. C.; Kim, H. Y. 2006. Detection of eight different events of genetically modified maize by multiplex PCR method. Food Science and Biotechnology, 15: 148–151. [online]. Acesso em 24/04/2020. Disponível em: http://www.koreascience.or.kr/article/JAKO200609905801382.page.

König, A.; Cockburn, A.; Crevel, R. W. R.; Debruyne, E.; Grafstroem, R.; Hammerling, U.; Kimber, I.; Knudsen, I.; Kuiper, H. A.; Peijnenburg, A. A. C. M.; Penninks, A. H.; Poulsen, M.; Schauzu, M.; Wal, J. M. 2004. Assessment of the safety of foods derived from genetically modified (GM) crops. Food and Chemical Toxicology, 42:1047–1088. Doi: https://doi.org/10.1016/j.fct.2004.02.019.

Marmiroli, N.; Maestri, E.; Gullì, M.; Malcevschi, A.; Peano, C.; Bordoni, R.; De Bellis. G. 2008. Methods for detection of GMOs in food and feed. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 392: 369–384. Doi: https://doi.org/10.1007/s00216-008-2303-6.

Matsuoka, T.; Kuribara, H.; Takubo, K.; Akiyama, H.; Miura, H.; Goda, Y.; Kusakabe, Y.; Isshiki, K.; Toyoda, M.; Hino, A. 2002. Detection of recombinant DNA segments introduced to genetically modified maize (Zea mays). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50:2100-2109. Doi: https://doi.org/10.1021/jf011157t.

Mazza, M. C. M.; Bittencourt, J. V. M. 2000. Extração de DNA de tecido vegetal de Araucaria angustifolia (Araucariaceae). Boletim de Pesquisas Florestais, 41:12-17. Disponível em: https://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/280588/1/mazza.pdf

Meyer, R. 1999. Development and application of DNA analytical methods for the detection of GMOs in food. Food Control, 10:391–399. Doi: https://doi.org/10.1016/S0956-7135(99)00081-X.

Miaw, C. S. W.; Amâncio, G.C.S.; Madeira, J. E. G. C.; Souza, S. V. C. 2014. Métodos para detecção de soja Roundup Ready® em grãos e produtos de soja por reação em cadeia da polimerase: revisão e análise crítica das práticas de validação. Revista do Instituto Adolfo Lutz, 73:9–25. Doi: https://doi.org/10.18241/0073-98552014731585.

Michelini, E.; Simoni, P.; Cevenini, L.; Mezzanotte, L.; Roda, A. 2008. New trends in bioinalitical tools for the detection of genetically modified organisms: an update. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 392: 355–367. Doi: https://doi.org/10.1007/s00216-008-2193-7.

Milavec, M.; Dobnik, D.; Yang, L.; Zhang, D.; Gruden, K.; Žel, J. 2014. GMO quantification: valuable experience and insights for the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 406: 6485–6497. Doi: https://doi.org/10.1007/s00216-014-8077-0.

Nascimento, V. E.; Pinho, E. V. R. V.; Pinho, R. G. V.; Santos, B. C.; Pereira, E. M.; Júnior, A. D. N. 2010. Especificidade e sensibilidade da técnica de PCR para detecção de milho geneticamente modificado. XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo – Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-rom. Retrieved on September 15, 2019. From: http://abms.org.br/eventos_anteriores/cnms2010/trabalhos/0361.pdf.

Nikolić, Z.; Milošević, M.; Vujaković, M.; Marinković, D.; Jevtić, A.; Balešević-Tubić, S. 2008. Qualitative triplex PCR for the detection of genetically modified soybean and maize. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 22: 801–803. Doi: https://doi.org/10.1080/13102818.2008.10817556.

Onishi, M.; Matsuoka, T.; Kodama, T.; Kashiwaba, K.; Futo, S.; Akiyama, H.; Maitani, T.; Furui, S.; Oguchi, T. Hino, A. 2005. Development of a multiplex polymerase chain reaction method for simultaneous detection of eight events of genetically modified maize. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 9713–9721. https://doi.org/10.1021/jf0515476.

Pereira-Filho, I. A.; Borghi, E. 2016. Mercado de sementes de milho no Brasil: safra 2016/2017. Embrapa Milho E Sorgo, 202: 1–28. [online]. Acesso em 24/04/2020. Disponível em: https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/1060346/1/doc2021.pdf

Schmutz, J., Cannon, S. B.; Schlueter, J.; Ma, J.; Mitros, T.; Nelson, W.; Hyten, D. L.; Song, Q.; Thelen, J. J.; Cheng, J.; Xu, D.; Hellsten, U.; May, G. D.; Yu, Y.; Sakurai, T.; Umezawa, T.; Bhattacharyya, M. K.; Sandhu, D.; Valliyodan, B.; Lindquist, E.; Peto, M.; Grant, D.; Shu, S.; Goodstein, D.; Barry, K.; Futrell-Griggs, M.; Abernathy, B.; Du, J.; Tian, Z.; Zhu, L.; Gill, N.; Joshi, T.; Libault, M.; Sethuraman, A.; Zhang, X. C.; Shinozaki, K.; Nguyen, H. T.; Wing, R. A.; Cregan, P.; Specht, J.; Grimwood, J.; Rokhsar, D.; Stacey, G.; Shoemaker, R. C.; Jackson, S. A. 2010. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean. Nature, 463: 178–183. Doi: https://doi.org/10.1038/nature08670.

Sika, C. K.; Kefela, T.; Adoukonou-Sagbadja, H.; Ahoton, L.; Saidou, A.; Baba-Moussa, L.; Baptiste, L. J.; Kotconi, S. O.; Gachomo, E. W. 2015. A simple and efficient genomic DNA extraction protocol for large scale genetic analyses of plant biological systems. Plant Gene, 1: 43–45. Doi: https://doi.org/10.1016/j.plgene.2015.03.001.

Tabima-Cubillos, L. Y.; Chaparro-Giraldo, A. Trujillo-Güiza, M. L. 2016. Detección de proteínas transgénicas en harinas de maíz comercializadas en Bogotá, Colômbia. Revista de Salud Publica, 18: 470-483. Doi: http://dx.doi.org/10.15446/rsap.v18n3.46923.

Tran, L. S P.; Mochida, K. 2010. Functional genomics of soybean for improvement of productivity in adverse conditions. Functional and Integrative Genomics, 10: 447–462. Doi: https://doi.org/10.1007/s10142-010-0178-z.

Vidal, N.; Barbosa, H.; Jacob, S.; Arruda, M. 2015. Comparative study of transgenic and non-transgenic maize (Zea mays) flours commercialized in Brazil, focussing on proteomic analyses. Food Chemistry, 180: 288–294. Doi: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.02.051.

Vieira, F. A.; Santana, J. A. S.; Santos, R. M.; Fajardo, G. C.; Coelho, G. A. O.; Carvalho, D. 2010. Métodos de extração de DNA e seleção de primers de cpDNA para Ficus bonijesulapensis (Moraceae). Revista Caatinga, 23: 69–74. [online]. Acesso em 24/04/2020. Disponível em: https://periodicos.ufersa.edu.br/index.php/caatinga/article/view/1403

Wu, H.; Zhang, Y.; Zhu, C.; Xiao, X.; Zhou, X.; Xu, S.; Shen, W.; Huang, M. 2012. Presence of CP4-EPSPS Component in Roundup Ready Soybean-Derived Food Products. International Journal of Molecular Science, 13: 1919–1932. Doi: https://doi.org/10.3390/ijms13021919.

Yamaguchi, H.; Sasaki, K.; Umetsu, H. Kamada, H. 2003. Two detection methods of genetically modified maize and the state of its import into Japan. Food Control, 14: 201- 206. Doi: https://doi.org/10.1016/S0956-7135(02)00062-2.

Zhang, D.; Guo, J. 2011. The development and standardization of testing methods for genetically modified organisms and their derived products. Journal of Integrative Plant Biology, 53: 539–551. Doi: https://doi.org/10.1111/j.1744-7909.2011.01060.x.

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Publicado

2020-05-02

Edição

v. 12 (2020)

Seção

ARTIGOS ORIGINAIS

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Como Citar

Padronização de método baseado em PCR e sequenciamento para detecção da presença do gene CP4 EPSPS em Zea mays. (2020). Caderno De Ciências Agrárias, 12, 1-9. https://doi.org/10.35699/2447-6218.2020.19990
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